杨帆 刘春来 刘亮 王爽 蒋希峰 李敏 曹大为 李新民

摘要 為挖掘生防新资源，采用组织分离法从21种野生药用植物不同组织部位分离纯化内生真菌，以6种植物病原菌为靶标菌筛选拮抗菌株，并根据形态学及分子生物学对菌株进行鉴定，在此基础上研究了高效拮抗菌株对靶标菌菌丝生长及孢子萌发的影响。结果表明：从分离纯化的478株内生真菌中筛选出11株高活性拮抗菌株，分属于青霉属Penicillium、平脐蠕孢属Bipolaris、棘壳孢属Pyrenochaeta、镰孢属Fusarium、粒毛盘菌属Lachnum、垫壳孢属Coniella和Neonectria 7个属，其中青霉属占比最高，达36.36%。平皿对峙试验表明，

棘壳孢菌12-R-5对灰葡萄孢表现出高效性和专一性，其对菌丝抑制率达66.67%。含药平皿试验表明，菌株12-R-5发酵滤液10倍稀释液对灰葡萄孢菌丝生长抑制率达100%，与其他处理差异显著。菌株12-R-5 10倍发酵滤液处理灰葡萄孢10 h，孢子不萌发;100倍稀释液处理对孢子萌发抑制率为91.01%。显微镜观察发现，棘壳孢菌使灰葡萄孢菌丝扭曲变形，膨大肿胀及断裂，部分菌丝发生缢缩、消融现象。说明棘壳孢菌12-R-5菌株具有很好的生防潜力及应用前景。

关键词 药用植物; 内生真菌; 植物病原菌; 拮抗作用

中图分类号： S 572

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020499

Isolation of endophytic fungi from medicinal plants and screening for antagonistic strains

YANG Fan1，2，3， LIU Chunlai2，3， LIU Liang2，3， WANG Shuang2，3，

JIANG Xifeng2，3， LI Min2，3， CAO Dawei2，3， LI Xinmin1，2，3*

（1. Postdoctoral Research Workstation， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， China;

2. Institute of Plant Protection， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， China;

3. Scientific Observation and Experimental Station of Crop Pests in Harbin， Ministry of

Agriculture and Rural Affairs， Harbin 150086， China）

Abstract

In order to explore new biocontrol resources， endophytic fungi were isolated and purified from different tissues of 21 wild medicinal plants by using tissue isolation method. Antagonistic strains were screened against six common pathogenic fungi， and the strains were identified based on morphology and molecular biology. The effects of antagonistic strains against target pathogens on mycelial growth and spore germination were further studied. The results showed that 11 highly active antagonistic strains were screened out from 478 strains of endophytic fungi， which belonged to Penicillium， Bipolaris， Pyrenochaeta， Fusarium， Lachnum， Coniella and Neonectria. Penicillium accounted for the highest proportion， up to 36.36% of the total. The inhibition rate  of the strain 12-R-5 against Botrytis cinerea hyphae was 66.67% by the plate confrontation test. The inhibition rate of 10-fold fermentation filtrate of 12-R-5  against pathogen hyphae growth reached 100%， which was significantly higher than other treatments. Pathogen spores treated 10-fold the fermentation filtrates of the strain 12-R-5 for 10 h could not germinate. When the spores were treated with 100-fold diluent， the inhibition rate of spore germination was 91.01%. According to microscopic observation， the strain 12-R-5 could cause the hyphae of B.cinerea to expand and twist， and some hyphae shrunk and melted. The results indicated that the strain 12-R-5 had a good biocontrol potential and application prospect.

Key words

medicinal plants; endophytic fungi; phytopathogens; antagonistic activity

Petrini于1991年将内生菌定义为在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，且没有引起植物组织明显病害症状的微生物[1]。同时植物内生菌的挖掘被认为是寻找具有潜在农业、医药和工业应用价值的天然产物的新领域[2-3]。药用植物是具有生物活性的天然化合物的丰富资源，且药用植物内生真菌能够产生与寄主植物相同或相似的活性成分[4-5]，而且在很大程度上仍未被开发[6]。因此从药用植物中分离得到内生真菌在寻找新的生物活性天然化合物方面具有重要的应用价值。在杀菌剂的研制中内生真菌代谢产物具有很大的潜力。传统药用植物被认为是新型内生真菌的重要来源[7-9]。

本研究以采自大兴安岭东麓内蒙古自治区呼伦贝尔市阿荣旗三岔镇新胜村处于营养生长阶段的野生药用植物为材料，采用组织分离法，进行内生真菌的分离、鉴定，从中筛选对植物病原菌拮抗作用较强的菌株，为挖掘野生植物内生真菌多样性及功能型拮抗菌株筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试植物

供试植物材料于2017年7月底采自大兴安岭东麓内蒙古自治区呼伦贝尔市阿荣旗三岔河镇新胜村，包括黄芩Scutellaria baicalensis、地丁草Corydalis bungeana、兴安石竹Dianthus chinensis、玉竹Polygonatum odoratum、小叶玉竹Polygonatum humile、地榆Sanguisorba officinalis、威灵仙Clematis chinensis、关防风Saposhnikovia divaricata、藜芦Veratrum nigrum、兴安乌头Aconitum ambiguum、毛筒玉竹Polygonatum inflatum、黄芪Astragalus mongholicus、毛百合Lilium dauricum、白藓Dictamnus dasycarpus、苍术 Atractylodes lancea、白芷Angelica dahurica、兴安柴胡Bupleurum sibiricum、苦参Sophora flavescens、漏芦Rhaponticum uniflorum、桔梗Platycodon grandiflorus、狼毒Euphorbia fischeriana，共21份野生植物样本。

1.2 供试病原菌

供试病原真菌为：大豆根腐病菌Fusarium oxysporum、玉米大斑病菌Setosphaeria turcica、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、马铃薯早疫病菌Alternaria solani、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、玉米茎基腐病菌Fusarium graminearum，以上病原菌菌株由黑龙江省农业科学院植物保护研究所生物防治研究室保存。

1.3 供试植物中内生真菌分离及纯化

采用组织分离法：植物样品的根、茎、叶、花、果反复用自来水冲洗掉泥污，滤纸上晾干。取野生植物健康组织根、茎、果5～7 mm，叶、花3 mm见方。各组织经70%乙醇浸泡5 s，根、茎、果经0.1%升汞浸泡1.5～2 min，叶、花经0.1%升汞浸泡30～45 s，无菌水漂洗3次，灭菌滤纸吸干表面水分，接在含有链霉素（400 μg/mL）的PDA平皿上，每皿4块组织，4次重复。于（25±1）℃培养箱中培养，每天观察至有菌丝长出。

消毒效果验证：取各组织最后1次无菌水冲洗液400 μL涂布于PDA平板，于（25±1）℃培养箱中黑暗培养3～5 d，观察有无菌落产生，若平皿表面无真菌生长，则表明组织表面灭菌彻底，所分离获得的是内生真菌，否则不能继续用于试验。

各组织培养2～3 d后，待培养组织边缘有菌丝长出时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落转移到新的PDA平皿继续培养，反复纯化并培养，对已纯化的菌株编号，转至PDA斜面培养基上，于（25±1）℃培养箱中培养5～7 d，4℃冰箱内保藏备用。

1.4 拮抗内生真菌初筛

采用平皿对峙培养法[10]，略改进。打取7 mm供试病原菌菌碟分别接在PDA平板中央，在距培养皿边缘1 cm处等距对称接种4株待测内生真菌菌碟，以单独接种病原菌为对照，每处理重复3次。（25±1）℃培养箱培养至对照皿中病原菌长满平皿，观察待测内生真菌是否有拮抗作用，并测量抑菌带宽。

1.5 拮抗内生真菌的鉴定

形态学鉴定：活化具有高效拮抗作用的菌株，取培养皿边缘直径7 mm菌碟，将菌碟转接于PDA平板中央，（25±1）℃培养箱黑暗培养，每隔2 d观察菌落形态，至菌丝长满平皿时，显微镜下观察菌丝、产孢结构以及分生孢子梗着生情况，对菌株进行初步鉴定。

分子生物学鉴定：利用通用引物ITS1和ITS4扩增菌株DNA，扩增产物进行1%瓊脂糖凝胶电泳，目的片段经DNA胶回收试剂盒回收纯化后送北京六合华大基因科技有限公司测序。将测序后获得的序列提交到NCBI，用BLAST完成序列分析，结合形态学鉴定菌株。

1.6 高效拮抗菌株12-R-5对灰霉菌的影响

1.6.1 对病原菌菌丝的影响

对峙培养法。用直径7 mm的打孔器分别在植物病原菌边缘、待测菌株12-R-5平板上打取菌碟，在直径90 mm PDA平板上取半径3.5 cm的圆周，沿直径对称接种病原菌和菌株12-R-5菌碟各一块，每处理重复3次。设只接种病原菌的平板为对照。置于（25±1）℃黑暗培养，待对照菌落长满培养皿，直尺测量抑菌带宽和处理组病原菌菌落半径，计算菌丝生长抑制率（IMG）。

IMG=（对照菌落半径-处理病原菌菌落半径）/对照菌落半径×100%。

琼脂扩散培养法。在PDA平板中央接种植物病原菌菌碟，在菌碟周围，按等边三角形等距离放置牛津杯，每孔接入菌株12-R-5发酵滤液250 μL，每处理重复3次。以每孔接入无菌PDB培养液为对照。置于（25±1）℃培养箱黑暗培养，待对照菌落长满培养皿，测量抑菌圈直径。

含药平皿法。用直径7 mm打孔器在拮抗菌株的菌落边缘打取菌碟，接种到150 mL PDB培养液中，每瓶3个菌碟，于（25±1）℃、180 r/min条件下振荡培养7 d。将发酵液在5 000 r/min下离心15 min，收集上清液，用0.22 μm细菌过滤器过滤，获得无菌发酵滤液，待用。待灭菌PDA培养基温度降至40℃左右时与拮抗菌株发酵滤液按不同体积比混合均匀，制得含不同稀释倍数（10、50、100、500倍和1 000倍）发酵滤液的平皿，将直径7 mm的病原菌菌碟接种至平皿中央，以不含发酵液的PDA平板上接种的病原菌为对照，置于（25±1）℃培养箱中黑暗培养，待对照PDA平皿菌落长满培养皿，十字交叉法测量各处理菌落直径，计算菌丝生长抑制率（IMG）。

IMG=（对照菌落直径-处理病原菌菌落直径）/对照菌落直径×100%。

1.6.2 对病原菌孢子萌发的影响

收集在PDB中培养7 d的病原菌，4层无菌纱布过滤病原菌菌丝体，获得病原菌孢子悬浮液，将菌株12-R-5发酵滤液与病原菌孢子悬浮液混合，得到稀释10、50、100、500倍和1 000倍的发酵滤液5个处理，以病原菌孢子悬浮液为对照，每处理3次重复。将各处理孢子悬浮液装入无菌试管中，置于（25±1）℃培养箱黑暗培养10 h检测孢子萌发率，以芽管长度超过孢子一半长度为标准，判定孢子萌发。

1.7 统计分析

试验数据采用SPSS数据处理系统进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗内生真菌初筛

试验共分离、纯化得到478株内生真菌，采用平皿对峙法测定分离菌株对6种靶标菌的抑菌作用，初筛获得具有拮抗作用的菌株61株，其中对6种靶标菌抑菌带宽≥5 mm的菌株有11株（表1）。

分离自地丁草果实的菌株2-Fr-8对6种病原菌菌丝生长均有较强的抑制作用，拮抗作用广谱且高效，分离自黄芪根部的菌株12-R-5对番茄灰霉病菌具有专一性，且拮抗作用很强（图1）。

2.2 拮抗内生真菌鉴定

通过NCBI进行BLAST比对，11株高效拮抗菌株分属于青霉属Penicillium、平脐蠕孢属Bipolaris、棘壳孢属Pyrenochaeta、镰孢属Fusarium、粒毛盘菌属Lachnum、垫壳孢属Coniella和Neonectria，共7个属：青霉属在7个属中占比最高，达36.36%。

2.3 菌株12-R-5对灰葡萄孢的拮抗作用

2.3.1 12-R-5对灰葡萄孢菌丝生长的影响

经鉴定12-R-5为棘壳孢属真菌。采用对峙培养法处理灰葡萄孢，可见边缘菌丝稀少疏松（图3a），菌株12-R-5对灰葡萄孢菌丝生长抑制率为（66.67±3.15）%。平板扩散培养法测定12-R-5发酵滤液对灰葡萄孢的抑制作用，发现牛津杯周边几乎不长菌丝，偶见稀少菌丝，抑菌直径为（20.83±3.78）mm（图3b）。在显微镜下观察，对照菌丝生长细长而均匀，并无膨大、崩解、畸形现象（图3c）。经发酵滤液处理的病原菌，菌丝生长受到严重的抑制，出现畸变现象，菌丝粗细不均，扭曲变形，膨大肿胀及断裂（图3d、e）。

在拮抗菌发酵滤液与PDA混合的平板上培养灰霉病菌，待对照PDA平皿上病原菌长满时，各处理下病原菌菌落直径有明显差异（图4）。发酵滤液稀释10、50、100、500倍和1 000倍处理对病原菌菌丝生长抑制率分别为100%、89.14%、8234%、4524%和35.65%。

2.3.2 12-R-5发酵滤液对孢子萌发的影响

随着稀释倍数的增加，12-R-5对孢子萌发的抑制作用减弱。不同稀释倍数的12-R-5发酵滤液处理灰葡萄孢孢子10 h后， 50、100、500倍和1 000倍发酵滤液对孢子的萌发抑制率分别为9340%、91.01%、78.63%和28.4%， 10倍稀释液平皿下病原菌孢子不萌发，孢子萌发抑制率可达到100%。

3 结论与讨论

自然界植物内生真菌种类多达100万种[11]。因其特殊的生长环境以及和寄主长期协同进化，药用植物内生菌可产生与寄主植物相同或相似的活性物质，成为了寻找和发现新颖而有价值的生物活性物质的研究热点[12-13]。具有生物活性的微生物次生代谢产物可直接开发成为农用抗生素应用于农业病虫害的防治[14]。目前已从沙冬青Ammopiptanthus mongolicus、老瓜头Cynanchum mongolicum、甘草Glycyrrhiza uralensis、苦参Sophora flavescens、杜仲Eucommia ulmoides 、枸杞Lycium barbarum等多种药用植物中获得对植物病原菌有抑制作用的内生菌[15-17]。本研究从21种野生药用植物中分离获得478株内生真菌，筛选出对多种植物病原菌具有高效拮抗作用的内生真菌菌株11株，为研究开发新型生物农药提供了丰富的生防微生物资源。

已报道的植物内生真菌绝大多数属于子囊菌Ascomycetes，无孢菌群的多种真菌以及半知菌中的链格孢属Alternaria、青霉属Penicillium、鐮孢属Fusarium真菌[18-19]。以药用植物烟草Nicotiana tabacum为材料，分离获得的539株内生真菌分属于31个属、73种，其中曲霉属Aspergillus和镰孢属为优势菌群[20]。从艾纳香Blumea balsamifera的根、茎、叶中分离获得的152株内生真菌具有丰富的物种多样性，分属于镰孢属、曲霉属、青霉属、木霉属Trichoderma、弯孢属Curvularia、脉孢菌属Neurospora、多节孢属Nodulisporium、间座壳属Diaporthe、茎点霉属Phoma、蜡质菌属Ceriporia和烟管菌属Bjerkandera 11个属，其中镰孢属、曲霉属、木霉属和弯孢属为艾纳香内生真菌的优势菌属[21]。本研究筛选得到的11株高效拮抗菌株分属于7个属，其中青霉属占36.36%，为优势菌属。

拮抗真菌抑菌机理主要体现在其具有较强的空间和营养竞争能力，能够产生抑菌活性物质抑制植物病原菌的生长，或诱导植物产生抗病性等多方面[15]。据报道，杜仲Eucommia ulmoides内生真菌嗦孢壳属Thielavia菌株DZGS08发酵液对玉米纹枯菌Rhizoctonia solani的抑制率达到50%以上[15]。分离自凤丹Paeonia ostii 根部的一株镰孢属内生真菌对毛霉Mucor sp.、链格孢和青霉等6种病原菌抑制率均在80%以上[22]。枸杞内生真菌镰孢属菌株NQ8GII4对胶孢炭疽菌Colletotrichum Gloeosporioides的抑制率高达93.43%[16]。棘壳孢属真菌作为感染人类皮肤、指甲的一类病原菌在医学研究中普遍报道，同时该属部分真菌以腐生菌的形式广泛存在于热带和亚热带的土壤、植物中，部分真菌也会导致番茄、玉米根腐病的发生[23-24]，但未见棘壳孢属真菌对植物病原菌具有拮抗作用的报道。本研究从野生黄芪根部筛选到的一株棘壳孢属真菌12-R-5菌株，对灰葡萄孢菌丝生长及孢子萌发有显著的抑制作用，并表现出高效专一性。有关菌株12-R-5的抑菌机理及其抑菌活性物有待深入研究，为研发微生物农药提供依据。

参考文献

[1] PETRINI O. Fungal endophytes of tree leaves[M]∥ ANDREWS J H， HIRANO S S. Microbial ecology of leaves. New York： Springer-Verlag， 1991： 179-197.

[2] ALVIN A， MILLER K I， NEILAN B A. Exploring the potential of endophytes from medicinal plants as sources of antimycobacterial compounds [J]. Microbiological Research， 2014， 169（7/8）：483-495.

[3] KHIRALLA A， MOHAMED I， THOMAS J， et al. A pilot study of antioxidant potential of endophytic fungi from some Sudanese medicinal plants [J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine， 2015， 8（9）：701-704.

[4] TIAN Yuan， AMAND S， BUISSON D， et al. The fungal leaf endophyte Paraconiothyrium variabile specifically metabolizes the host-plant metabolome for its own benefit [J]. Phytochemistry， 2014， 108（9）： 95-101.

[5] SUNIL D， MANISH G， VED P， et al. Endophytic fungi： a source of potential antifungal compounds [J]. Journal of Fungi， 2018， 4（3）： 77-119.

[6] KUMAR S， KAUSHIK N. Metabolites of endophytic fungi as novel source of biofungicide： A review [J]. Phytochemistry Reviews， 2012， 11（4）：507-522.

[7] HUANG Wuyang， CAI Yizhong， HYDE K D， et al. Biodiversity of endophytic fungi associated with 29 traditional Chinese medicinal plants [J]. Fungal Diversity， 2008， 33： 61-75.

[8] 鄭朝辉， 刘艳云， 范黎. 黄芩内生真菌N.SBA10代谢产物抗氧化活性及结构鉴定[J].菌物学报， 2012， 31（6）：917-923.

[9] 徐全智， 孙牧笛， 李帆， 等. 宁夏枸杞内生真菌的分离及多样性分析[J].北方园艺， 2017， 41（10）：103-109.

[10]杨帆， 刘春来， 王爽， 等. 一株平沙绿僵菌的鉴定及生防应用潜力评价[J].植物保护， 2018， 44（5）：199-205.

[11]GOKHALE M， GUPTA D， GUPTA U， et al. Patents on endophytic fungi [J]. Recent Patents on Biotechnology， 2017， 11（2）：120-140.

[12]ALY A H， EDRADA-EBEL R， INDRIANI I D， et al. Cytotoxic metabolites from the fungal endophyte Alternaria sp. and their subsequent detection in its host plant Polygonum senegalense [J]. Journal of Natural Products， 2008，71（6）：972-980.

[13]单体江， 冯皓， 谢银燕， 等. 柠檬桉内生真菌的分离及其提取物的抗细菌活性[J].植物保护， 2019， 45（6）：149-155.

[14]展丽然， 张克诚， 冉隆贤， 等. 农用抗生素筛选模型的发展概述[J]. 微生物学杂志， 2008， 31（6）：91-94.

[15]丁婷， 孙微微， 王帅， 等. 杜仲内生真菌中抗玉米纹枯病活性菌株的筛选[J].植物保护， 2014，40（6）：29-35.

[16]胡丽杰， 严思远， 李嘉泓， 等.枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌Colletotrichum Gloeosporioides的拮抗作用及生防潜力[J].植物保护， 2020，46（1）：125-133.

[17]XIANG Libo， GONG Shuangjun， YANG Lijun. Biocontrol potential of endophytic fungi in medicinal plants from Wuhan Botanical Garden in China [J]. Biological Control， 2016， 94： 47-55.

[18]YAO Yuqun， LAN Fang， QIAO Yunming， et al. Endophytic fungi harbored in the root of Sophora tonkinensis Gapnep： Diversity and biocontrol potential against phytopathogens [J/OL]. MicrobiologyOpen， 2017， 6（3）： e00437. https：∥doi.org/10.1002/mbo3.437.

[19]谢海伟， 冯嘉琪， 付晓晴， 等. 药用植物内生真菌的研究进展[J].江苏农业科学， 2020， 48（14）：1-6.

[20]李盼盼， 袁晓龙， 李金海， 等. 湖北烟草内生真菌生物多样性和种群结构分析[J].微生物学报， 2018， 58（10）：1853-1863.

[21]唐青， 周思旋， 雷帮星， 等. 贵州西南部艾纳香内生真菌多样性研究[J].菌物学报， 2017， 36（11）：1498-1503.

[22]郑燕， 戴婧婧， 管玉鑫， 等.凤丹内生菌的分离鉴定及抑菌活性研究[J].中国中药杂志， 2016， 41（1）：45-50.

[23]TOH Y F， YEW S M， CHAN C L， et al. Genome anatomy of Pyrenochaeta unguishominis UM 256， a multidrug resistant strain isolated from skin scraping [J/OL]. PLoS ONE， 2016， 11（9）： e0162095. DOI：10.1371/journal.pone.0162095.

[24]GONG Yu， CHEN Zeyu， MAYuee， et al. Cutaneous phaeohyphomycosis caused by Pyrenochaeta unguis-hominis in a diabetic patient： A case report [J/OL]. Australasian Journal of Dermatology， 2020， 61（2）：e221-e222. DOI：10.1111/ajd.13177.

（責任编辑：杨明丽）