李学思，王 杨，曹振华，詹 胜

（1.河南牧业经济学院食品与生物工程学院（酒业学院），河南郑州 450046；2.河南省食品工业科学研究所有限公司，河南郑州 450053；3.河南省宋河酒业股份有限公司，河南鹿邑 477265）

窖泥质量的好坏以及窖泥内微生物对白酒质量优劣有着极其重要的影响[1]。传统的浓香型大曲白酒生产方法主要依靠自然接种窖泥，自然驯化，自然老熟[2-3]。生产优质浓香型白酒可能需要很长的时间。随着人们对优质白酒需求的高速发展，采用窖泥自然老熟法生产浓香型白酒已远远不适应社会的发展。因此，培养窖泥功能菌并利用其加速窖泥老熟已成为现代企业的当务之急。

然而，要人为提升窖泥品质或人为加速窖泥老熟，其本质就是调整窖泥内的微生物结构与分布。对于白酒企业而言，研究窖泥微生物群落和窖泥功能菌，实现窖泥微生物的有效人工干预调节，使窖泥加快转变为优质窖泥，养护窖泥并影响其微生物种类及含量，是提高窖泥质量的关键[4-5]。本项目主要以宋河酒业不同窖龄浓香型白酒发酵窖池为研究对象，通过感官评定与气相色谱分析不同窖池所产出原酒质量，探索优质原酒与窖池主要有益功能微生物的关系，研究浓香型白酒不同窖龄窖池泥的微生物含量及多样性对酒质的影响。本课题结合窖泥微生物群落结构与酒质的优劣，对窖泥窖龄与各窖泥微生物的关联性进行分析，判断窖泥各类微生物对窖泥的影响。为强化窖池有益微生物，加强窖池养护提供科学依据，为提高产品质量打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 材料

原酒取样：选择各窖窖底酒醅蒸馏的前50 kg原酒混合样。

窖池：选择宋河酒业窖龄3 年、5 年、10 年具有代表性的窖池，取其窖池中部的窖壁泥及窖池底部的窖底泥，其中窖底泥取窖池底部中心与窖池底部四角（约100 g/份），即五点取样法，同一窖龄窖池选取4 口窖池。将窖泥均匀混合后立即低温保存，然后进行后续微生物分离培养实验。

本实验采用窖泥与酒样均由宋河酒业微生物实验室提供。

1.1.2 试剂（表1）

表1 实验试剂

1.1.3 仪器设备（表2）

表2 实验仪器

1.2 培养基配方

1.2.1 营养琼脂培养基[6]

成分：蛋白胨5 g，牛肉膏1.5 g，氯化钠1.5 g，琼脂8.5 g，蒸馏水500 mL，pH7.2。

将除琼脂外的各类成分溶于无菌蒸馏水中，校正pH 值至7.2，融入琼脂，分装于准备好的烧瓶中，121 ℃高压灭菌15 min。

1.2.2 YEPD培养基

成分：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂粉。

溶解5 g 酵母膏,10 g 蛋白胨于450 mL 水中，加入10 g 琼脂粉，121 ℃高压灭菌20 min，加入50 mL含10 g葡萄糖的溶液。

1.2.3 PDA培养基

成分：马铃薯（去皮）100 g，葡萄糖10 g，琼脂10 g，水500 mL。

简单处理马铃薯，然后称取100 g 加入500 mL蒸馏水，煮沸20 min，冷却后用纱布过滤，滤液补足水至500 mL，溶解相应糖和琼脂，121 ℃灭菌20 min。

1.2.4 高氏一号培养基

成分：可溶性淀粉4 g，KNO20.8 g，NaCl 0.2 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O0.004 g，融入琼脂8 g，蒸馏水400 mL，pH7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。

1.2.5 麦氏培养基

将葡萄糖0.5 g，KCl 0.9 g，酵母汁1.25 g，醋酸钠4.1 g，琼脂8.5 g，放入蒸馏水500 mL，灭菌30 min，pH值自然。

1.3 实验方法

1.3.1 平板稀释计数[7-8]

根据不同微生物生长习性的不同，我们针对不同微生物采用不同培养基进行培养，选用牛肉膏蛋白胨培养基作为细菌用培养基，选用YEPD 培养基作为酵母菌用培养基，采用PDA 培养基作为霉菌用培养基，选用高氏一号培养基作为放线菌用培养基，采用麦氏培养基作为芽孢菌用培养基。

取新鲜准备好的窖泥40 g，放入360 mL 带有玻璃珠的无菌蒸馏水中，在30 ℃条件下于摇瓶中振荡30 min，静置30 min，然后吸取上清液1 mL，将其混于含有9 mL 无菌蒸馏水的试管中进行稀释，依次稀释到10-4，从适当的稀释液中取200 μL 菌液，涂布在相应的平板上，均匀涂布，每个稀释度做2 个平行样。细菌选择10-3～10-4稀释度进行涂布，丝状真菌选择10-1～10-2稀释度进行涂布，放线菌选择10-1～10-2稀释度进行涂布，酵母菌选择10-1～10-2稀释度进行涂布。在恒温培养箱中按照各类菌种最适温度倒置培养涂布好的平板样品。细菌在35 ℃条件下恒温培养1～2 d，丝状真菌在28 ℃条件下恒温培养2～3 d，酵母在28 ℃条件下恒温培养2～3 d，放线菌在28 ℃条件下恒温培养3～4 d。

根据芽孢菌具有耐热性，取40 g 新鲜准备好的窖泥并将它们置入360 mL 含有玻璃珠的无菌蒸馏水中，置于80 ℃条件下水浴中20 min，置30 ℃条件下振动台中30 min，静置30 min 后，吸取1 mL 处理好之后的菌液，将其添加在含有9 mL 无菌蒸馏水的试管中混合均匀，用相同的方法依次稀释至10-3，在制备好的醋酸钠培养基上均匀涂布200 μL稀释液，均匀涂布后将适当的液体石蜡注入板中，以密封氧气。恒温培养箱控制在35 ℃条件下，在此条件下正置培养刚制作完成的平板。

1.3.2 气相色谱分析

目前评定白酒质量优劣有多种方法，常用的方法主要是感官品评和理化分析，本实验理化分析主要以气相色谱法测定白酒中己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯四大酯含量[9-11]。

样品预处理：白酒样品采用直接进样法进行分析，进样时取100 μL内标和5 mL酒样。

内标的配制：准确量取5.00 mL乙酸正丁酯，然后用体积分数为60%乙醇溶液定容至250 mL，摇匀，作为内标溶液。

色谱条件：色谱条件：进样口温度250 ℃；柱温箱升温程序：40 ℃保持1 min，2 ℃/min 升至70 ℃，然后以4 ℃/min 升温至160 ℃，再以10 ℃/min 升温至250 ℃，保持5 min；载气：99.999%高纯度氮气，载气流速：1 mL/min，不分流进样。

1.3.3 感官评定

感官质量由具有品酒师职业资格专业技术人员进行品评，对不同窖龄窖池所产酒样进行感官评定，以色、香、味、格4 种指标进行综合评定；最后汇总评分结果，计算出平均得分。

2 结果与分析

2.1 窖泥微生物数量变化结果分析

2.1.1 酵母菌(表3)

表3 不同窖龄窖泥中酵母菌数量变化（×103cfu/g）

由表3 可以看出：伴随着窖池窖龄的增长，窖泥中无论是池底还是池壁酵母菌总数也随之增长，且窖壁酵母菌数量增长速度较池底快。在同一窖龄窖池中，池壁的酵母菌数量总是高于窖底的酵母菌数量。无论是池底酵母菌数量还是池壁酵母菌数量都与窖龄呈显著的正相关关系，进一步表明了随着窖龄的提升，无论是池底酵母菌还是池壁酵母菌数量同时提升。

2.1.2 细菌(表4)

表4 不同窖龄窖泥中细菌数量变化（×103cfu/g）

由表4 可以看出：随着不同窖池窖龄的增加，不同窖池窖泥中细菌的含量也在增高，且同一窖龄池底窖泥细菌数量增长速度高于池壁，池底细菌总数基本高于池壁细菌总数。无论是池底细菌数量还是池壁细菌数量都与窖龄呈显著的正相关关系，进一步表明了随着窖龄的提升，无论是池底细菌还是池壁细菌数量同时提升。

推测这是由于窖泥中的环境由于缺乏氧气，所以更加符合兼性细菌和厌氧性细菌最适生存环境，随着窖池的老化和窖龄的不断增加，窖泥中的缺氧条件使得越来越多的兼性细菌和严格厌氧细菌生长繁殖，相对的，一些好氧性细菌被淘汰[12-13]；窖池底部的含氧量相对窖壁更低，所以更加适合兼性及厌氧细菌的生长，所以窖池底部的细菌总数增长相对窖壁细菌总数较快。

2.1.3 霉菌(表5)

由表5 可以看出：窖泥中的霉菌相对其他菌类含量较少，不同窖龄的窖泥中霉菌随窖龄变化幅度较小，且同一窖池的不同部位霉菌数量相差较小。无论是池底霉菌还是池壁霉菌数量与窖龄未出现显著关联性。

表5 不同窖龄窖泥中霉菌数量变化（cfu/g）

2.1.4 放线菌(表6)

由表6 可以看出：伴随着窖池窖龄的增长放线菌含量也在不断增加，池壁放线菌均多于池底放线菌，且池壁放线菌随窖龄增长而增长速率大于池底放线菌随窖龄增长速率。无论是池底放线菌还是池壁放线菌含量都与窖龄呈显著正相关性。进一步表明了随着窖龄的提升，无论是池底还是池壁放线数量同时提升。推测可能是因为放线菌以好氧型放线菌为主，最适环境为含水量较低，具有丰富有机物的中性或碱性环境。池壁含水量相对池底较低，且酸度接近中性，符合放线菌最适环境，所以同一窖池池壁放线菌相对池底较高。

2.1.5 芽孢菌(表7)

由表7 可以看出，无论是好氧芽孢菌还是厌氧芽孢菌，其池底与池壁含量均随着窖龄的增加而增加。厌氧芽孢菌随窖龄增长其增长速率快于好氧芽孢菌，同一窖池池壁的好氧芽孢菌含量多于池底好氧芽孢菌，同一窖池池壁的厌氧芽孢菌含量少于池底厌氧芽孢菌。无论在窖池何部位，厌氧芽孢菌和好氧芽孢菌均与窖池窖龄呈现显著正相关性，进一步表明了随着窖龄的提升，无论是好氧芽孢菌还是厌氧芽孢菌在窖泥中数量增加。

2.2 原酒质量分析

2.2.1 理化分析

根据窖池窖泥微生物分析结果，取对应窖池所产两个级别原酒进行色谱分析，结果见表8。

表8 酒样色谱分析结果 （g/L）

由表8 可以看出，随着窖龄的延长，四大酯的含量呈上升趋势，且四大酯中含量最高的为己酸乙酯，浓香型白酒的香气成分以己酸乙酯为主要成分，己酸乙酯含量的增长有益于塑造浓香型白酒酒香的典型性。而乳酸乙酯含量一般是低于己酸乙酯的，适当浓度乳酸乙酯能够使白酒呈现糟香味，口感绵软柔和，但若含量过多时，则白酒会呈现出苦涩和不爽的口感，香气受到抑制呈现闷感。

2.2.2 感官品评

取对应窖池所产调味酒和优级酒，对所产基酒进行感官尝评[14]，由5 位国家级品酒师和10 位省级品酒师根据相关文献[15-16]进行共同品评打分，从香气、口感、风格等方面进行综合评定，结果见表9。

表9 酒样感官评定结果

由表9 感官评定结果能够看出：随着窖池窖龄的提升，窖池所产原酒的感官质量呈上升趋势，主要原因是随着窖池窖龄的提升，窖池窖泥内微生物数量及分布发生变化，从而使窖池所产原酒品质更加醇厚丰满。

3 结论

窖池窖泥中富含多种微生物并形成了一个复杂且丰富的微生物生态系统，窖池窖泥在窖池窖龄增长的过程中由于受到内在或外在各种不同因素的影响，窖池窖泥中各种微生物在窖泥中的含量和分布也在发生变化，窖池随着窖泥内微生物的变化所产原酒的品质同时会发生改变。

3.1 通过对宋河酒业窖池窖泥微生物进行分析，结果发现随着窖池窖龄的增加，窖池酵母菌含量、细菌含量和放线菌含量无论其池底还是池壁均随窖池窖龄而增长，同一窖龄窖池酵母菌和放线菌含量窖池池壁多于窖池池底，窖池池壁细菌含量少于窖池池底；霉菌在窖池中含量较少，随窖池窖龄变化不明显；窖池池底和窖池池壁好氧芽孢菌和厌氧芽孢菌含量均随窖池窖龄增长而增高，厌氧芽孢菌随窖龄增长速率快于好氧芽孢菌，同一窖龄窖池好氧芽孢菌窖池池壁含量多于窖池池底，厌氧芽孢菌窖池池壁含量少于窖池池底；除霉菌外其他菌种均与窖池窖龄呈显著正相关性。

3.2 对不同窖龄窖池所产原酒质量进行感官品评和理化分析等综合评定，白酒中主要风味物质随着窖池窖龄的增长而提高，其感官质量也随着窖池窖龄的延长而明显提高。

3.3 比对窖泥微生物的变化与所产原酒质量，随着窖池窖龄的提升，窖池内窖泥所含放线菌、细菌、酵母菌、芽孢菌等主要功能菌的数量有所增加，所产原酒质量也呈明显提高趋势，说明原酒质量与窖池窖龄以及窖池泥中有益功能菌数量成正相关。窖池窖泥中放线菌、细菌、酵母菌以及芽孢菌这4类菌种在窖泥中的数量分布在一定程度上可以作为衡量该窖池窖泥是否达到成熟的标志，这为进一步研究窖池窖泥中各有益菌种、窖池养护以及人工培养窖泥供了理论依据。