林妹珠 黄惠娟 倪清丽 董怡君 刘宗玉 蔡芬 张小蕊

1. 中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院妇产科，福建 福州 350025 2. 福建医科大学福总临床医学院，福建 福州 350025 3. 厦门大学附属东方医院，福建 福州 350025

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于雌激素水平下降，骨代谢水平改变导致骨矿密度、骨质量下降，骨结构退化、脆性增加，骨微结构改变等一系列变化的全身骨代谢相关疾病。最新流行病学调研指出，美国约有1 000万50岁以上的人患有骨质疏松症，经济负担巨大，在美国和英国每年约花费179亿美元和40亿英镑用于治疗[1], 骨质疏松症已经是一个世界范围的主要健康问题。PM2.5(particulate matter 2.5)指的是空气动力学直径≤2.5 μm的颗粒物，其成分复杂，含无机成分、有机成分、重金属等，可直接进入人体肺泡，危害健康。研究发现，长期暴露在PM环境下，与骨质疏松的发生具有密切相关性[2]。在骨质疏松临床筛查和诊治中，双能 X 射线吸收测定法测量骨密度被公认为诊断的金标准，但是骨密度反映骨量的多少，并不能反映骨微结构的改变情况[3]。显微计算机断层扫描术(micro-computed content，Micro-CT)可以在3 D上测量骨小梁骨微结构变化，从而对骨矿物进行定量定性分析，对诊断骨质疏松症的发生发展过程更为敏感和可靠，为临床研发骨骼药物提供更多机会[4]。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

3周龄约50 g的SPF级雌性健康SD大鼠24只，由第九○○医院比较医学实验科实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0001。SD大鼠适应性生长1周后随机分为对照组，低、中、高剂量组，每组6只，进行PM2.5悬浊液气道滴注，每3天滴注1次。其中对照组滴注生理盐水，低、中、高剂量组滴注PM2.5悬浊液浓度分别为：35、70、150 μg/m3。在气道滴注的第5个月末行去势手术，第九个月末取材。

1.2 PM2.5悬浊液制备

PM2.5的采集地点为福州市鼓楼区，使用Thermo Science GUV-15-H-1(美国)大流量采样器和Thermo Science G1200-41 PM2.5采样头，流量1.13 m3/min，用石英纤维膜(美国Whataman公司)采集PM2.5。采样前将纤维膜于马沸炉中450 ℃焙烧5 h，以消除可能载带的有机物。每24小时更换一次纤维膜。将收集好PM2.5的纤维膜剪成1 cm×1 cm大小，加入超纯水，置于超声振荡器中，4 ℃振荡2 h后用8层无菌纱布过滤。将过滤好的液体置于无菌离心管内，低温高速离心(4 ℃，12 000 r/min，30 min)后去除上清液，沉淀物质用真空冷冻干燥机干燥12 h。称重后，加入PBS磷酸盐缓冲液配置成所需浓度的悬浊液，保存于4 ℃冰箱。

1.3 PM2.5暴露

1.3.1PM2.5暴露浓度标准：PM2.5暴露浓度标准参照中华人民共和国环境空气质量标准(GB3095-2012)一、二级标准24小时平均年浓度限值(35、75 μg/m3)以及《环境空气质量指数(AQI)技术规定(试行)》规定，重度污染的PM2.5浓度大于150 μg/m3。

1.3.2PM2.5气道滴注：将麻醉好的SD大鼠固定，暴露气道，用棉签清理口腔后，用腰麻针套管作为气道滴注针，向气道内滴注相应浓度的PM2.5悬浊液，成功后用2.5 mL针管向气道内注入一管空气。拔出滴注针，观察大鼠状态良好后放回饲养笼。

1.4 SD大鼠去势造模

在PM2.5气道滴注的第5个月末，行去势手术。去势术前禁食禁水8 h，手术器械高压灭菌。麻醉后取背部切口，逐层切开皮肤、肌肉，分离脂肪后可见粉色卵巢，结扎输卵管并切除卵巢后逐层缝合、消毒，观察出血情况。同法摘除另一侧卵巢。术后密切观察大鼠皮肤切口情况，精神状态等，在术后3天内定期消毒伤口，肌注青霉素预防感染，如有伤口裂开则二次缝合。确保手术成功去卵巢，在取材时检查卵巢是否缺失。

1.5 取材

乙醚吸入麻醉处死SD大鼠后，用高压灭菌后的手术器械取出其右侧股骨、胫骨以及腰椎，剔除周围结缔组织及血管神经组织等，用生理盐水浸润纱布包裹标本后放入病理袋中，存于-20 ℃冰箱以待micro-CT扫描。

1.6 micro-CT扫描

用micro-CT扫描仪(MCT-Sharp，中国)扫描时，将胫骨、股骨、腰椎分别沿长轴固定于固定器内，设置电压为70 kV，功率7 W，100 μA，4帧叠加，角度增益0.72 °，曝光时间100 ms，分辨率为20 μm。扫描得到prj格式图像，重建后生成IMO文件，通过Medproject软件处理，得到三维图像及分析结果。其中选取胫骨距生长板远端2 mm，层厚1.5 mm的骨组织为松质骨感兴趣区域进行三维重组定量分析；选取股骨Ward三角区，层厚0.5 mm的骨组织为松质骨感兴趣区域进行三维重组定量分析；选取与上下椎间面等距的，层厚为1.6 mm的椎体骨组织为松质骨感兴趣区域进行三维重组扫描定量分析。相关参数如下：骨小梁骨密度(trabecular bone mineral density，Tb.BMD)、骨体积(bone volume，BV)、松质骨感兴趣区域(region of interest，ROI )、总体积(total volume，TV)、相对骨体积或骨体积分数(BV/TV)、结构模型指数(structure model index，SMI)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation/spacing，Tb.Sp)[5]。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 PM2.5暴露组与对照组胫骨、股骨Ward三角区、腰椎骨微结构参数的比较

2.1.1PM2.5暴露对雌性SD大鼠胫骨的影响：与对照组相比，PM2.5暴露组胫骨骨小梁的Tb.BMD减小、BV/TV减小、SMI增大、Tb.Th减小、Tb.N减少、Tb.Sp增加；其中相较于对照组，胫骨骨小梁的BV/TV、Tb.Th、Tb.N 、Tb.Sp的改变差异有统计学意义(P<0.05)，Tb.BMD、SMI的改变差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 各组胫骨骨参数改变Table 1 The changes of tibial bone parameters in each

2.1.2PM2.5暴露对雌性SD大鼠股骨Ward三角区的影响：与对照组相比，PM2.5暴露组股骨Ward三角区骨小梁的Tb.BMD减小、BV/TV减小、SMI增大、Tb.Th减小、Tb.N减少、Tb.Sp增加；其中相较于对照组，股骨Ward三角区骨小梁的Tb.BMD、BV/TV、SMI、Tb.N 、Tb.Sp的改变差异有统计学意义(P<0.05)，Tb.Th的改变以及低剂量组BV/TV的改变差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

表2 各组股骨骨参数改变Table 2 The changes of femoral bone parameters in each

2.1.3PM2.5暴露对雌性SD大鼠腰椎的影响：与对照组相比，PM2.5暴露组腰椎骨小梁的Tb.BMD减小、BV/TV减小、SMI增大、Tb.Th减小、Tb.N减少、Tb.Sp增加；其中相较于对照组，腰椎骨小梁的SMI、Tb.Th、Tb.N 、Tb.Sp的改变差异有统计学意义(P<0.05)，Tb.BMD、BV/TV的改变以及低剂量组Tb.Th的改变差异无统计学意义(P>0.05)，详见表3。

表3 各组腰椎骨参数改变Table 3 The changes of vertebral bone parameters in each

2.2 Micro-CT 重建

2.2.1PM2.5暴露对胫骨骨微结构micro-CT的影响：如图1所示，各组胫骨髓腔内容物稀疏，相比对照组，胫骨髓腔随着PM2.5悬浊液浓度的增高而变得更稀疏，甚至高剂量组已完全空虚。从图1中A2～D2可见，对照组的骨小梁有少许断裂不完整，杆状结构少，多数为片状结构，而随着PM2.5悬浊液暴露浓度增高，骨小梁愈来愈不连续和缺损，数量减少，骨小梁之间的间隙变大，骨小梁多数为杆状结构。

注：A 对照组；B 低剂量组；C 中剂量组；D 高剂量组图1 各组大鼠胫骨及其骨小梁结构的micro-CT三维重建图Fig.1 Three-dimensional micro-CT reconstruction of the tibia and its trabecular structure in rats of each group。

2.2.2PM2.5暴露对股骨Ward三角区骨微结构micro-CT的影响：如图2所示，股骨近端其股骨头内骨小梁相对完整，对照组与低剂量组股骨髓腔内骨小梁分布稀疏、相差不大；随着PM2.5悬浊液暴露浓度的增加，髓腔内骨小梁分布稀疏、间隙变大。股骨解剖Ward三角区的micro-CT三维重建图2中A4～D4可见，各组骨小梁均为松散不连续的、间隙变大，但整体上相差不大。

注：A 对照组；B 低剂量组；C 中剂量组；D 高剂量组。图2 各组大鼠股骨近端及股骨ward三角区骨小梁的micro-CT三维重建图Fig.2 Three-dimensional micro-CT reconstruction of bone trabeculae of the proximal femur and Ward triangle of the femur in rats of each group

2.2.3PM2.5暴露对腰椎骨微结构micro-CT的影响：如图3所示，各组腰椎椎体变得稀疏；相对于对照组，随着PM2.5悬浊液暴露浓度增高，腰椎椎体骨间隙变大，完整性破坏甚至断裂。从图3中A6-D6可见，随着PM2.5悬浊液暴露浓度增高，骨小梁变得更加不连续，间隙增大、数量减少甚至缺损，杆状结构增多。

注：A 对照组；B 低剂量组；C 中剂量组；D 高剂量组。图3 各组大鼠腰椎及其骨小梁的micro-CT三维重建图Fig.3 Three-dimensional micro-CT reconstruction of the lumbar vertebrae and its trabeculae in rats of each group

3 讨论

绝经后骨质疏松症的特征是骨量减少，骨组织微结构恶化，导致骨脆性增加，继而增加骨折的风险，因此早期识别其发生具有重要意义。有研究者通过对去卵巢后的SD大鼠腰椎骨微结构动态观察发现，去势后SD大鼠的骨吸收大于骨形成，骨微结构开始改变且在去卵巢后的第12周后才显现出骨质疏松症状[6]。本研究参照此方法，在去势前后都对雌性SD大鼠行气道滴注PM2.5悬浊液，旨在观察PM2.5是否会加重雌性SD大鼠绝经后骨量减少。

众多研究表明，空气中的细颗粒物PM2.5可以引发呼吸系统、心血管系统等多系统疾病而对骨骼系统的影响及其机制研究较少。Micro-CT分辨率高、无创，检测时可以精确定位所观察区域，因此是研究骨小梁结构的重要工具。本研究的结果表明，PM2.5暴露使去势雌性SD大鼠的胫骨、股骨以及腰椎骨小梁数量减少和骨小梁分离度增加，胫骨的各组骨微结构差异相对比较明显；在股骨和腰椎的骨微结构改变中，相对于对照组，中、高剂量组有一定的差异。说明PM2.5暴露对于去势后雌性SD大鼠胫骨骨微结构的改变较为明显，使骨量减少，而一定浓度的PM2.5暴露也可以改变股骨和腰椎的骨量。由此可见，对于空气污染严重的城市，关注绝经后人群骨骼健康尤为重要。

micro-CT三维重建图中可以更直观地看出各组间的松质骨骨微结构的显著差异，有研究者对骨质疏松性椎体压缩性骨折进行micro-CT影像学分析，结果提示micro-CT检测对于骨小梁骨微结构的变化更为敏感和准确，已经是一种广泛应用的无创新兴技术[7]。松质骨为多孔的疏松结构，具有不均一性和各向异性，检测其骨微结构参数的改变对于预测骨强度的改变具有重要意义：骨小梁骨密度反映骨量的多少，骨密度降低即骨量丢失；骨小梁数量减少、骨小梁分离度变大、骨小梁厚度变小都反映了骨量减少；结构模型指数反映骨小梁板状和杆状梁比值大小，骨量减少时，板状骨小梁减少，杆状骨小梁增加，即结构模型指数数值增加[8]。本研究中检测指标符合骨量减少趋势，说明PM2.5暴露可致绝经后胫骨、股骨、腰椎骨量减少。卵巢切除术可诱导高骨周转率和快速骨量丢失的状态，在8～9个月内建立新的稳定的骨量[9]。而我们建模一般选择去势后3～4个月检测相关指标改变，从结果看胫骨的大部分指标相对于对照组有明显改变，股骨和腰椎则不明显，提示我们，胫骨对于雌激素缺乏以及PM2.5暴露所引起的改变更为敏感。从micro-CT三维重建图也可发现胫骨各组结构改变尤为明显，而股骨和腰椎各组其骨小梁结构改变差异相对不明显，但是骨小梁片状结构也是减少，杆状结构相对增多。

有学者[10]通过研究PM2.5影响老年雄性大鼠骨组织形态学的改变，其结果提示长期暴露于PM2.5环境中，骨髓中的成骨细胞可能通过RANKL/OPG信号通路途径，释放RANKL与破骨细胞上的RANK受体结合，从而诱导产生更多成熟的破骨细胞，使骨吸收增强，打破了骨吸收和骨形成的平衡过程，导致老年骨质疏松的发生。众所周知，绝经后卵巢功能减退，雌激素水平低下，骨代谢相关指标发生异常变化，即发生绝经后骨质疏松症的概率增加。本研究证明处于PM2.5环境中，去势的雌性SD大鼠骨小梁的骨微结构发生骨质疏松样改变，证明PM2.5暴露可加重绝经后骨质疏松症的发生发展进程。因此，研究PM2.5暴露对绝经后骨质疏松症的影响及其相关发病机制，通过阻断和抑制相关信号途径来达到治疗或者减缓绝经后骨质疏松症的发生，对于提高患者生活质量具有重要意义。

综上，PM2.5暴露可引发或者加重绝经后骨质疏松症的发生，其具体机制还有待于进一步研究。本研究所检测数量相对较少，日后还有待收集更多相关临床样本等做进一步的研究和验证。