杨 娜，曹建萌，刘志刚，高风英，可小丽，王 淼，衣萌萌，卢迈新

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广州 510380；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

罗非鱼(Tilapia)隶属于鲈形目(Perciformes)鲡鱼科(Cichlidae)，是世界重要的水产养殖品种。从上世纪五十年代开始，我国先后引进了尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、奥利亚罗非鱼(Oreochromisaureus)和吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus,GIFT)等品种，罗非鱼的养殖也带动了良种繁育、饲料加工、鱼类规模化养殖和水产品加工等产业的快速发展，目前中国已经成为世界上罗非鱼出口和产量最多的国家[1]。罗非鱼在我国的主产区主要分布在广东、广西、海南、云南和福建等南方地区，其中吉富罗非鱼的养殖面积约占60%，是目前主要养殖的罗非鱼品种之一。

杂交是鱼类遗传育种技术中广泛采用的一种手段，包括种内杂交和远缘杂交，种内杂交一般是同种内的不同品系、不同品种的个体间的杂交[2]。宣云峰[3]用长江、珠江水系草鱼(Ctenopharyngodonidellus)种群进行种内杂交，获得了杂交后代家系及群体组合，发现杂交后代遗传变异水平显著提高，具有较高的选育潜力，在生长性能和体型特征上均具有优势。远缘杂交是指不同物种之间的杂交，可以是种间、属间、科间或者亲缘关系更远的物种之间的杂交[4]。鱼类中种间杂交的如乌斑鳢[乌鳢(Channaargus)(♀)×斑鳢(Channamaculata)(♂)][5]和合方鲫[日本白鲫(Carassiusauratuscuvieri)(♀)×红鲫(CarassiusauratusRedVariety)(♂)][6]等在生产上获得了较大的经济价值。在鱼类属间杂交中，三角鲂(Megalobramaterminalis)(♀)和翘嘴鲌(Culteralburnus)(♂)及其属间杂交子代具有显著的超双亲生长优势，且体质量也显著高于对照组[7]。

父母本的亲缘关系越远，更可能将生物的优良性状通过杂交综合于杂种中，杂种优势也较为明显，但杂交相容性都很低，往往存在杂交不易成功和杂交后代存活率低等问题[8]。翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)隶属于鲈形目真鲈科(Percichthyidae)鳜属(Siniperca)，具有生长快、肉质细嫩、耐寒性强和营养价值高等优点[9]。目前已报道的关于罗非鱼和鳜的远缘杂交有奥利亚罗非鱼(♀)与翘嘴鳜(♂)的科间杂交，子代成活率为0.3%～0.5%[10]。本研究进行了吉富罗非鱼(♀)与翘嘴鳜(♂)的远缘杂交研究，探索吉富罗非鱼(♀)与翘嘴鳜(♂)杂交的可行性，研究正常发育的杂交子代的胚胎发育、细胞遗传和分子遗传特征，丰富鱼类远缘杂交的基础数据，以期为吉富罗非鱼(♀)与翘嘴鳜(♂)远缘杂交F1的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

实验鱼均取自中国水产科学研究院珠江水产研究所高要水产种质中心。吉富罗非鱼5尾(♀)，体重900.0～1 000.0 g；吉富罗非鱼5尾(♂)，体重1 000.0～1 100.0 g；翘嘴鳜5尾(♂)，体重700.0～800.0 g。亲鱼在人工繁殖前放养于循环水养殖系统中。水温控制在(26.5±0.5) ℃，pH为8.1±0.1，氨氮量低于0.1 mg/L，溶解氧大于5.8 mg/L，光暗周期为12L ∶12D。每天吸出残饵并及时补充因吸出损失的水。吉富罗非鱼每天上午下午各投喂一次饲料，翘嘴鳜每天上午下午各投喂一次适口饵料鱼。

1.2 人工繁殖

吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)为实验组，吉富罗非鱼(♀)×吉富罗非鱼(♂)为对照组。吉富罗非鱼和翘嘴鳜的人工授精方法参考Cao等[11]的方法进行。

1.3 胚胎发育

用Olympus解剖镜(Nikon P-RN2，南京衡桥仪器有限公司)观察胚胎发育过程。授精当天每0.5 h取样观察一次，第二天开始每12 h取样观察一次，直至胚胎孵化出鱼苗。每次统计时随机抽取800～1 400粒胚胎，受精后1 h统计胚胎受精率，胚胎发育至孵化期时统计胚胎孵化率，胚胎发育至首次喂养阶段时统计胚胎存活率。受精率=(受精卵数目/卵子总数)×100%；孵化率=(出苗数/受精卵数目)×100%；存活率=(开口时的鱼苗数/受精卵数目)×100%[12]。多次重复实验，并使用SPSS26.0对实验数据进行统计学差异的单因素显著性分析。

1.4 DNA含量检测

1.4.1 实验材料

吉富罗非鱼自交组受精后10 d(10 days post-fertilization,10 dpf)的胚胎10枚，吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)10 dpf的胚胎20枚。所有胚胎均为发育正常的胚胎。

1.4.2 实验方法

在Sysmex CyFlow®Ploidy Analyser倍性分析仪(Sysmex-Partec公司)上用CyStain®UV Precise P试剂盒对每尾个体的DNA含量进行流式细胞检测。取300 μL的染色缓冲液放入培养皿中，放入300 μL的染色缓冲液中裂解，用刀片垂直把样品切碎，用30 μm的滤膜过滤样品，向过滤后的样品中加入1 200 μL DAPI染色溶液，上机检测。吉富罗非鱼自交组的子代为二倍体参照，并使用SPSS26.0对实验数据进行统计学差异的单因素显著性分析。

1.5 染色体数目观察

1.5.1 实验材料

吉富罗非鱼5尾，体重800.0～900.0 g；翘嘴鳜5尾，体重600.0～700.0 g；杂交子代5尾，体重170.0～180.0 g。

1.5.2 实验方法

参照淡水黑鲷染色体标本制备方法[13]并加以改进，按10 μg/g鱼体重的剂量腹腔注射植物血细胞凝素(PHA)，24 h后，按照1 μg/g鱼体重腹腔注射秋水仙素，2 h后在水中剪鳃放血，取头肾组织制备细胞悬液。头肾组织放入加有10 mL生理盐水的小烧杯中，用剪刀剪碎组织直至无明显大组织块，经1 500 r/min离心5 min后收集细胞，加入0.037 5 mol/L KCl溶液，低渗30 min，离心后加入新配制的卡诺氏固定液(甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1)，固定2次。固定后再次离心后取沉淀，加入适量的固定液重悬细胞，用吸管吸取细胞悬液滴在洗好的载玻片上，过酒精灯火焰3次，自然晾干。染色体标本经染色液(Giemsa染液 ∶磷酸盐缓冲液=1 ∶9)染色后用蒸馏水冲洗干净并晾干，置于Olympus DM 4000B显微镜下进行观察拍照和统计分析。随机选取100个来自不同细胞的分散良好、形态清晰的中期分裂相染色体(20个/尾)，通过统计分析确定染色体数目，并使用SPSS26.0对实验数据进行统计学差异的单因素显著性分析。再拍照、放大并剪下其中的10个中期分裂相染色体，然后按LEVAN[14]提出的标准进行染色体测量、分类及核型分析。

1.6 微卫星分析

1.6.1 实验材料

用1尾吉富罗非鱼(♀)和1尾翘嘴鳜(♂)构建一个全同胞家系，采集两亲本和杂交子代20尾(体重130.0～140.0 g)的尾鳍样本。采集吉富罗非鱼群体(20尾，中国水产科学研究院珠江水产研究所高要水产种质中心，体重500.0～600.0 g)、尼罗罗非鱼无锡群体(20尾，无锡淡水渔业研究中心，体重600.0～700.0 g)的尾鳍样本。将所有样本的尾鳍置于无水乙醇中保存。其中全同胞家系中的父本和杂交子代群体为一组，后续用翘嘴鳜的微卫星标记进行微卫星分析；全同胞家系中的母本、杂交子代群体、吉富罗非鱼群体和尼罗罗非鱼无锡群体为一组，后续用罗非鱼的微卫星标记进行微卫星分析。

1.6.2 DNA提取

使用HiPure Tissue DNA Micro Kit试剂盒(购自广州美基生物科技有限公司)提取各尾鳍样本的基因组DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，微量分光光度计(OSE-260，购自北京天根生化科技公司)检测DNA的浓度及纯度。用ddH2O将基因组DNA稀释至终浓度为50 ng/μL，置于-20 ℃保存。

1.6.3 微卫星引物的合成

罗非鱼和翘嘴鳜的微卫星标记均为已开发的多态性水平较高的微卫星标记[15-16]。从已开发的翘嘴鳜微卫星标记中筛选出10对在吉富罗非鱼群体中扩增不出条带但在翘嘴鳜群体中多态性较高的微卫星标记，10对标记的登录号分别是AY395717.1、AY395718.1、DQ789291、JQ686834、JQ804746、JQ804762、GR476841、GR476843、GR476286、GR476056。从已开发的罗非鱼微卫星标记中筛选出10对在吉富罗非鱼群体中多态性较高的标记，10对标记的登录号分别是BV005323、G64061、G68185、G68187、G68214、G68228、G68231、G68242、G68250、G68253。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.6.4 微卫星PCR扩增条件及产物检测

翘嘴鳜的微卫星引物的扩增条件及产物检测：PCR反应体系为20 μL，包括：DNA模板1 μL(50 ng/μL)，上、下游引物各0.4 μL，2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR Mix(with blue eye)10 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR热循环程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58～64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环数为27个，最后72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，产物上样量为2 μL，50 bp ladder上样量为2 μL，电泳缓冲液为1×TBE，先使用50 V低电压电泳30 min，再使用150 V电压电泳150 min[17]。电泳完成后将玻璃板分离，把聚丙烯酰胺凝胶置于0.1% AgNO3溶液中染色10 min，再用ddH2O漂洗染色后的凝胶，稍后凝胶放置显色液(称取5 g NaOH固体和0.25 g无水Na2CO3固体，加ddH2O溶解定容至500 mL，使用前加2 mL CH2O)中显色7～10 min。染色及显色时放摇床轻轻摇晃，直至出现条带。用50 bp Marker条带估算条带大小，统计每个微卫星位点等位基因大小、种类和数目。

罗非鱼的微卫星引物的扩增条件及产物检测：PCR反应体系为20 μL，包括：DNA模板1 μL(50 ng/μL)，上、下游引物各0.4 μL，2 × M5 HiPer plus Taq HiFi PCR Mix(with blue eye)10 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR热循环程序为：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性25 s，56～65 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，循环数为28个，最后72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存。制备聚丙烯酰胺凝胶。用50 bp Marker条带估算条带大小，统计每个微卫星位点等位基因大小、种类和数目。用软件Popgen32计算各位点的观测杂合度(Observed heterozygosity)、期望杂合度(Expect heterozygosity)和Nei’s遗传距离，用POPTREE软件对各群体进行NJ聚类分析。

2 结果与分析

2.1 胚胎发育

吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)子代的胚胎发育至囊胚期前的阶段与吉富罗非鱼自交组发育同步。吉富罗非鱼自交组的胚胎发育至原肠期时，杂交子代的胚胎出现发育停滞高峰。吉富罗非鱼自交组的胚胎发育至体节分化期时，杂交子代的胚胎发育进度明显慢于吉富罗非鱼自交组。吉富罗非鱼自交组的胚胎发育至孵化期时，杂交子代的胚胎存活情况可分为四类：正常胚胎、亚正常胚胎、畸形胚胎和严重畸形胚胎。亚正常胚胎表现为有心跳，没有闭合的血液循环系统，血管发育异常，血细胞聚集在卵黄一侧等症状；畸形胚胎表现为体轴缩短，围心腔水肿，有心跳无闭合的血液循环等症状；严重畸形胚胎表现为头部发育异常，小眼或无眼，围心腔水肿严重，体轴缩短并伴有严重的脊索弯曲等症状。上述三种不同程度的畸形胚胎在孵化过程中不断死亡，到开口期部分畸形个体虽然存活，但无法摄食，后续全部死亡。此外，杂交子代中表型正常的胚胎，从孵化期到开口期这段时间内陆续也有死亡。吉富罗非鱼自交组和杂交组的胚胎受精率分别是(98.90±1.09)%和(95.61±1.19)%(表1)，杂交组的胚胎受精率显著低于自交组(P<0.05)。吉富罗非鱼自交组的胚胎孵化率是(95.66±1.59)%，杂交组的胚胎孵化率是(16.25±1.64)%，吉富罗非鱼自交组的胚胎存活率是(92.38±1.25)%，杂交组的胚胎存活率是(0.34±0.13)%，杂交组的胚胎孵化率和存活率都极显著低于自交组(P<0.01)(表1)。

表1 吉富罗非鱼自交组和吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)子代的胚胎受精率、孵化率和存活率统计

2.2 DNA含量分析

吉富罗非鱼自交组和吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)正常子代的平均DNA含量峰值分别为12 945.59和13 292.90(图1)，吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)正常子代的平均DNA含量与吉富罗非鱼自交组的子代的平均DNA含量比值为1.03，并且与预期值1相比无显著性差异(P>0.05)。

图1 DNA相对含量直方图

2.3 染色体数目统计及核型分析

2.3.1 染色体数目统计

吉富罗非鱼的染色体众数为44，众数出现频率为88%，结果表明其染色体数目为2n=44(表2)；翘嘴鳜的染色体众数为48，众数出现频率为92%，结果表明其染色体数目为2n=48(表3)；吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)子代的染色体众数为44，众数出现频率为83%，结果表明其染色体数目为2n=44(表2)。杂交子代的染色体众数与吉富罗非鱼的染色体众数相同，杂交子代的染色体众数与翘嘴鳜的染色体众数差异显著(P<0.05)。

表2 吉富罗非鱼和杂交子代的染色体众数统计

表3 翘嘴鳜的染色体众数统计

2.3.1 染色体核型分析

吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)子代具有3对亚中部着丝点染色体、12对亚端部着丝点染色体和7对端部着丝点染色体，染色体核型公式为6sm+24st+14t，染色体臂数(NF)=50(表4，图2)。吉富罗非鱼具有3对亚中部着丝点染色体、13对亚端部着丝点染色体和6对端部着丝点染色体，其染色体核型公式是6sm+26st+12t，NF=50(表5，图2)。4对翘嘴鳜具有4对亚中部着丝点染色体、5对亚端部着丝点染色体和15对端部着丝点染色体，核型公式是8sm+10st+30t，NF=56(表6，图2)。

表4 杂交子代染色体相对长度(RL)和臂比(AR)(平均值±标准差)

续表4

表5 吉富罗非鱼染色体相对长度(RL)和臂比(AR)(平均值±标准差)

表6 翘嘴鳜染色体相对长度(RL)和臂比(AR)(平均值±标准差)

图2 吉富罗非鱼、杂交子代和翘嘴鳜的有丝分裂中期染色体

2.4 分子遗传学分析

10个翘嘴鳜微卫星标记在父本翘嘴鳜和杂交子代群体中的扩增结果显示，10个微卫星标记在父本翘嘴鳜中均扩增出条带，在杂交子代群体中均无条带出现，图3为微卫星Sc90在父本翘嘴鳜和杂交子代群体中的扩增结果。

图3 微卫星Sc90在父本翘嘴鳜和杂交子代群体中的扩增结果

10个罗非鱼微卫星标记在全同胞家系的母本及其子代群体中均扩增出条带，且条带大小均相同。10个罗非鱼微卫星标记在杂交子代群体、吉富罗非鱼群体和尼罗罗非鱼无锡群体中共扩增出69个等位基因，每个位点等位基因的数量为1个或2个，这些引物扩增的带宽范围为100～300 bp。在吉富罗非鱼群体中，UNH846、UNH849、UNH954、UNH940、UNH920、UNH916、UNH960位点的多态性较高，GM131、UNH773、UNH896位点的多态性较低。在杂交子代群体中，所有位点的多态性都很低。在尼罗罗非鱼无锡群体中，UNH896、UNH940、UNH846、UNH849、UNH916、UNH920、UNH954和UNH960位点的多态性水平较高，GM131和UNH773位点的多态性水平较低。图4为微卫星UNH916在三个群体中的扩增结果。

图4 微卫星UNH916在三个群体中的扩增结果

三个群体基因变异参数见表7。三个群体中，杂交子代群体的平均观察纯合度和平均期望纯合度最高。三个群体间遗传相似系数和遗传距离见表8。杂交子代群体和吉富罗非鱼群体间的遗传距离最小，吉富罗非鱼群体和尼罗罗非鱼无锡群体间的遗传距离最大。根据遗传距离，用MEGA5软件对3个群体进行聚类分析。聚类分析结果显示：杂交子代群体与吉富罗非鱼群体聚为一支，其次是尼罗罗非鱼无锡群体(图5)。

表7 吉富罗非鱼群体、杂交子代群体及尼罗罗非鱼无锡群体的变异参数

表8 吉富罗非鱼群体、杂交子代群体与尼罗罗非鱼无锡群体间遗传相似系数和遗传距离

图5 基于Nei氏(1978)无偏遗传距离构建的NJ聚类树

3 讨论

鱼类杂交过程中最关键的是杂交亲本的相容性，造成远缘杂交不相容的主要原因可能是双亲的染色体数目、双亲DNA之间的相容性和协调性、双亲细胞质之间的相容性和协调性和双亲DNA与细胞质之间的相容性和协调性差别过大，使两者形成的合子基因调控不协调，最终造成胚胎发育障碍[18]，如由于草鱼的染色体数目(2n=48)和鲤的染色体数目(2n=100)差异太大和核质的不协调等，草鱼(♀)和鲤(♂)的二倍体杂种很难成活[19]。

吉富罗非鱼(♀)与翘嘴鳜(♂)的杂交属于科间杂交，其胚胎受精率和胚胎孵化率分别为(95.61±1.19)%和(16.25±1.64)%，胚胎存活率仅为(0.34±0.13)%，藏雪等[20]进行了河川沙塘鳢(♀)与云斑尖塘鳢(♂)的科间杂交，只有0.3%左右的胚胎能成活，唐永凯等[21]进行了奥利亚罗非鱼(♀)与鳜(♂)的科间杂交，统计胚胎存活率为0.2%～0.3%，相关的研究表明远缘杂交子代的存活率很低，这可能与科间杂交存在一定程度的配子不亲和有关。Polonis等[22]研究虹鳟(Oncorhynchusmykiss)与褐鳟(Salmontrutta)的基因组的不亲和性，发现细胞核的不亲和性不是导致杂交种异常的唯一原因，虹鳟(♀)×褐鳟(♂)的早期胚胎的存活率较高，应该是染色体的消除和碎裂过程中，亲本物种之间的基因组不匹配和细胞核冲突的程度较轻，基于目前的结果还无法确定吉富罗非鱼与翘嘴鳜之间是否存在染色体碎裂情况，后续将开展相关研究。

DNA相对含量分析的结果显示，吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)子代是二倍体。吉富罗非鱼和翘嘴鳜的染色体数目和核型已有报道[23-24]，本研究中的吉富罗非鱼和翘嘴鳜的染色体数目与已有报道一致，核型分析与已有报道存在差异，这可能是由于染色体核型的分析方法和测量染色体长度时的误差导致的。杂交子代的染色体数目与其母本相同，核型更接近母本，杂交子代的染色体数目和核型与父本不同。这与曹丽萍等[24]对奥利亚罗非鱼、鳜及其杂交子一代的染色体数目的分析结果一致。此外，根据唐永凯等[21]进行的奥利亚罗非鱼(♀)与鳜(♂)的受精细胞学研究，在奥利亚罗非鱼(♀)与鳜(♂)有正常的受精程序和常规的卵裂方式，胚胎发育中只有鳜染色体整套丢失而奥利亚罗非鱼染色体进行自然加倍的个体才能够存活，推测杂交子代很可能是受鳜精子刺激的雌核发育个体。由本研究的结果可以推测，正常成活的杂交子代是吉富罗非鱼卵子染色体加倍获得的，推测吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)子代是雌核发育个体。远缘杂交诱发雌核发育的现象已有许多报道，一般认为雌核和雄核未发生融合，卵子的染色体加倍形成了天然的雌核发育二倍体，Wang等[25]进行鲤(2n=100)(♀)与团头鲂(2n=48)(♂)的属间杂交，发现后代中存在雌核发育二倍体。

10个翘嘴鳜微卫星标记在全同胞家系的父本翘嘴鳜和杂交子代群体中的扩增结果显示，各微卫星位点在父本翘嘴鳜中均扩增出条带，在杂交子代群体中均没有扩增出条带，表明杂交子代不具有父本的遗传物质。10个罗非鱼微卫星标记在全同胞家系的母本吉富罗非鱼和杂交子代群体中均扩增出条带，且条带大小相同，表明杂交子代遗传了母本的遗传物质。对杂交子代群体、吉富罗非鱼群体、尼罗罗非鱼无锡群体进行微卫星分析，结果表明杂交子代群体的平均观测纯合度和平均期望纯合度最高，聚类分析结果显示该杂交子代群体与吉富罗非鱼群体聚为一支，其次是尼罗罗非鱼无锡群体。王金龙等[26]采用RAPD和测序的方法对奥利亚罗非鱼(♀)与鳜(♂)的杂交F1组合与亲本的遗传关系进行研究，结果表明杂交子代中导入了父本的遗传物质。简林江等[27]探讨大黄鱼(Larimichthyscrocea)(♀)与鮸状黄姑鱼(Nibeamiichthioides)(♂)属间远缘杂交的可行性，并利用10个微卫星标记对杂交亲本及F1进行遗传分析，发现存活的个体都是雌核发育后代。郑国栋等[28]进行团头鲂‘浦江1号’(♀)与翘嘴鲌(♂)的属间人工杂交，获得了遗传背景不同的杂种A型和杂种B型子代，微卫星分析结果显示杂种A型为二倍体杂交种，杂种B型的带型与母本相同，属于雌核发育后代。

细胞遗传和分子遗传特征的结果显示，吉富罗非鱼(♀)×翘嘴鳜(♂)子代属于雌核发育个体。