郭启勇，吴心华，张瑞雪，任 曼，唐玉林，郭延生*

（1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；2.甘肃省陇南市动物卫生监督所，甘肃 陇南 746000）

【研究意义】奶牛在围产期物质代谢和内分泌系统中都发生着巨大的变化，在围产期内普遍存在能量负平衡（negative energy balance，NEB）[1]，较长一段时间碳水化合物摄入不足和泌乳消耗大量的糖，导致血糖降低，机体为满足能量的需要而动用大量体脂，使得血中非脂化脂肪酸浓度升高，血液中非酯化脂肪酸（NEFA）和β-羟基丁酸（BHBA）浓度升高[2]。研究表明奶牛酮病不但影响奶牛的产奶量和牛奶质量，还会继发其他疾病。【前人研究进展】引起奶牛酮病的主要原因是碳水化合物和脂肪代谢紊乱；其次，真胃变位、前胃迟缓、产后瘫痪、乳房炎、瘤胃臌气、创伤性网胃炎、钙、磷等矿物质的缺乏和内分泌紊乱也可以引发酮病。在围产后期，分娩应激会导致奶牛采食量降低，而体内脂肪动员容易产生大量的非酯化脂肪酸和酮体，引起酮病。酮病根据发病原因，分为原发性和继发性；根据临床症状的不同，分为神经型、瘫痪型和消化型，其中以消化型最为常见[3]。酮病可导致每头牛在整个泌乳期产奶量损失200～230 kg[4]。

【本研究切入点】我国规模化牧场的酮病发病率在15%～30%，并且逐年递增[5]，酮病根据病程分为临床型酮病和亚临床型酮病，血液中的酮体是血液中丙酮、乙酰乙酸和β羟丁酸的总和，临床上通过BHBA预测奶牛健康和生产状况，1.5～2.9 mmol/L 定为亚临床型酮病，3 mmol/L 以上定为临床型酮病[6]。亚临床酮病在过渡期奶牛中流行，典型的牛群发病率在40%～60%[7-8]。BHBA 浓度增加会抑制糖异生，减少DMI和造成免疫抑制，BHBA 的检测作为现代规模化牧场兽医临床常用的监测手段，通过测定BHBA 的大小来制定奶牛产后的保健方案[9]。BHBA 已经用来定义牧场产后奶牛是否患有临床型酮病或亚临床型酮病，BHBA 与奶牛的健康和生产性能有直接关系[10-11]。目前关于产后奶牛不同酮体值下生理机能变化的研究较少，【拟解决的关键问题】本研究通过对奶牛产后不同酮体值的生理指标进行测定和分析，旨在揭示产后奶牛在不同BHBA下生理机能的变化规律。

1 试验材料

1.1 试验动物及样品采集

试验动物均为中国荷斯坦奶牛，样品采集均于2019年9月至11月在宁夏某规模化奶牛养殖场进行。选取2～3 胎次的荷斯坦奶牛20 头。奶牛场每天挤奶3 次，采用全混合日粮（TMR）饲喂，自由饮水，围产期按照围产期奶牛饲料配方饲喂。产后1 h 内将益康XP 250 g、丙酸钙450 g、硫酸镁100 g、盐50 g、丙二醇200 mL 和温水20 L 混合经瘤胃导管灌服。采集产后0，7，14，21，28 d等时间段的血液样品，肝素抗凝分离血浆，-196 ℃液氮保存。

1.2 主要仪器及样品检测

超低温冰箱（Thermo，美国）；Varioskan Flas F 全波长多功能酶标仪（Thermo，美国）;迈瑞兽用全自动生化分析仪（深圳迈瑞，中国），血酮检测仪（Abbott Diabetes，墨西哥）；LD4-2A 低速离心机（北京离心机厂，中国）等。

极低密度脂蛋白（VLDL）酶联免疫分析法，非酯化脂肪酸（NEFA）、总胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）酶比色法，谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）速率法，碱性磷酸酶（ALP）酶动力学法，谷氨酰转移酶（GGT）γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺法，总蛋白（TP）双缩脲法，白蛋白（ALB）溴甲酚绿法，低密度脂蛋白（LDL-C）选择性清除法，高密度脂蛋白（HDL-C）选择性抑制法，载脂蛋白A（APoA1）、载脂蛋白B（APoB）免疫浊度法。

1.3 统计方法

采用SPASS 25.0 进行单因素方差分析，结果用平均值±标准误（X—±SD）表示，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果分析

2.1 不同BHBA下肝功能相关生化指标测定

血浆中AST、GLB、TP 的浓度临床型组极显著高于其他组（P＜0.01）；血浆中ALP 的浓度正常组极显著低于其他各组（P＜0.01）；血浆中GGT亚临床组显著高于其他组（P＜0.05）；血浆中ALB的浓度各组之间差异不显著（P＞0.05）；血浆中ALT 的浓度临床型组极显著低于其他各组（P＜0.01）；血浆中GLB 的浓度临床型组显著高于其他各组（P＜0.05）。详细见表1和图1。

图1 不同BHBA奶牛肝功相关生化指标变化规律Fig.1 Changes in liver function-related biochemical indicators of cows with different BHBA

表1 不同BHBA奶牛肝功相关生化指标测定Tab.1 Determination of liver function-related biochemical indicators of cows with different BHBA （n=10，X—±SD）

2.2 不同酮体值下奶牛脂代谢相关生化指标检测

血浆中BHBA 的浓度临床组极显著高于其他各组（P＜0.01）；血浆中LDL-C、HDL-C 的浓度临床组显著高于其他各组（P＜0.05），且随着酮体值的升高呈现升高趋势；血浆ApoA1、ApoB 浓度在NEB 组显著高于其他各组（P＜0.05）；血浆中NEFA、TCH、TG 浓度临床组极显著高于其他各组（P＜0.01），且随着酮体值的升高呈现升高趋势，详见表2和图2。

图2 不同BHBA奶牛脂质代谢相关生化指标变化规律Fig.2 Changes in lipid metabolism-related biochemical indicators of dairy cows with different BHBA

表2 不同BHBA奶牛脂质代谢相关生化指标变化规律Tab.2 Biochemical indexes related to lipid metabolism of different BHBA dairy cows（n=9，X—±SD）

3 讨论与结论

3.1 酮体值对肝功能的影响

肝脏是能量代谢和转化的主要场所，对奶牛的正常生产具有重要意义。AST 存在于组织的细胞质或线粒体中，特别是在肝脏、心脏和骨骼肌中[12]。因此，这些组织中AST 活性最高。当脂肪肝发生时，细胞膜通透性增加，酶释放到血液中，血液中酶的活性增加，AST 还可以作为脂肪肝诊断中肝脂沉积的标志物[13]。在本研究中，临床型组BHBA 的浓度极显著于其他组，BHBA 大于2.3 mmol/L 时，血浆中AST 的浓度最高，AST 升高说明奶牛存在不同程度的肝脏损伤[14]。本研究中临床型酮病组奶牛血浆中AST 的浓度显著高于其他各组，说明酮体值的升高与肝脏的破坏呈现正相关。也有资料表示当奶牛血浆中AST＞100 U/L，奶牛就存在脂肪肝风险[15]。GGT 主要存在于家畜的肾脏，在奶牛乳腺中，GGT 存在于腺体上皮，活性可能与氨基酸代谢强度有关[16]，本研究中亚临床型组显著高于其他组，这可能与奶牛在亚临床酮病时期的泌乳有关，也有研究表明肝脏的代谢紊乱也会加剧血液中GGT 浓度的升高[17]。

TP具有维持血液正常胶体渗透压和pH，调节被运输物质的生理作用和营养作用等功能。血清总蛋白不仅可用于机体营养状态的监测，还可用于疾病的诊断及鉴别诊断[18-19]。随着BHBA 的升高，临床型组显著高于其他各组，说明酮体除了影响奶牛的DMI、氧化应激和肝细胞凋亡，还导致肝脏TP 的可用性和蛋白质生物合成的降低。血浆中ALP 的含量在NEB 组和亚临床型组明显高于其他两组，说明当BHBA 达到1.4 以上时，肝脏已经开始受到损伤。ALP 存在于机体肝脏的组织中，当肝脏发生疾病时，血浆中ALP 增多。ALB 在各组之间没有表现差异性，ALB 用于维持身体渗透压和酸碱平衡[20]，说明酮体值的变化没有影响奶牛的体液平衡。当机体遭遇到外来侵害时，免疫系统会刺激淋巴细胞产生更多的GLB，直到入侵物被球蛋白消灭为止[21-22]，本研究中临床型组血浆中GLB 的浓度显著高于其他各组，说明酮体值升高导致免疫能力下降，容易受到病原微生物的侵袭。

3.2 酮体值对脂代谢的影响

脂质不溶于血浆，无法直接运输到肾上腺，性腺等组织，转运过程中必须将其包装成脂蛋白[23]。HDL-C除了抑制脂质氧化、抗炎和抗细胞凋亡的作用之外，还具有促进胆固醇的逆向转运。将外周血液和组织中的胆固醇运送到肝脏，合成脂蛋白、维生素和激素[24]。在本研究中发现，随着BHBA 的升高，血浆中HDL-C 的浓度也在升高，而且临床型组极显著高于其他组。说明肝脏代谢的异常会促进脂质氧化分解。LDL-C 是富含胆固醇的脂蛋白，运载胆固醇进入外周组织细胞的脂蛋白颗粒，其余的则由VLDL携带[25]。LDL-C 在临床上通常用来监测心血管疾病，通过调节LDL-C 来治疗心血管疾病[26]。有研究表明血浆中LDL-C 升高，血脂代谢就会发生异常[27]，本研究中临床组显著高于其他各组，说明BHBA 的升高能够影响血脂代谢，促使产后奶牛脂质代谢异常。

ApoA1 是ApoA 族最多的一种组分，是HDL 中的主要载脂蛋白[28]，可以调节血浆和细胞内的脂质代谢，通过直接受受体介导的机制促进儿茶酚胺诱导的脂肪分解[29]。在本研究中，NEB 组显著高于其他3 组，但ApoA1的变化并不具备规律性，ApoA1的组内差异较大，关于BHBA 是否是影响ApoA1变化的因素还需要做进一步研究。ApoB 由肝脏合成，是LDL-CHOL 的主要结构蛋白，主要功能是运输脂类物质和充当LDL 受体用来介导清除配体[30]。研究中发现，当BHBA 升高之后，开始呈现显著上升趋势，说明BHBA升高之后ApoB会相应的升高。

血浆中NEFA 的浓度直接反映脂肪组织的破坏程度。NEFA 浓度过高会导致肝脏脂肪浸润，这与围产期代谢性疾病的发病率较高有关[31]。NEFA还可以作为肝脏功能代谢的评价指标[32]。临床型组显著高于其他各组，这与前人研究一致[33]。说明NEFA进入肝脏生成酮体越高。NEFA具有肝毒性，可以增强细胞因子如肿瘤坏死因子的毒性，增加线粒体肿胀和渗透性、肝细胞变性、坏死或凋亡[34]。关于NEFA与酮病的关系，与之前的研究结果一致[35]。

TG 和TCH 是衡量血脂的重要指标，在动物体内不能直接溶于血浆，在体内的运输需要包装成脂蛋白颗粒，主要分为乳糜微粒、VLDL、LDL 和HDL[36]。本次研究中TG 随着BHBA 的显著升高，临床组显著高于其他各组，说明酮体会导致TG 代谢障碍。反刍动物利用TG 有两种方式，一种是经过水解生成脂肪酸，另一种是以VLDL 运出体外。由于反刍动物缺乏脂蛋白酶，所以水解TG 的能力就会下降，主要以VLDL 的形式排出体外[37]。TCH 是构成生物膜和血浆脂蛋白的可氧化脂质[38]，本研究中TCH 随着BHBA的升高呈现显著性升高趋势，说明生成酮体需要消耗的大量TCH。

酮体值可以作为肝脏代谢和脂质代谢的预警。