李 芬，肖佳敏，秦宇辉，林永慧，孔祥仕，何兴兵*

（1.吉首大学 生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.吉首大学 生态旅游重点实验室，湖南 张家界 427000）

【研究意义】内源真菌（Endophytic fungi），又称为内生真菌，一般以共生关系存在于植物组织中[1-2]。然而，目前的一些研究显示内源真菌可以参与凋落物分解且对分解过程产生了一定程度的影响[3]。内源真菌作为一种先锋定殖者，可以直接利用凋落物的有机成分，同时也可以通过拮抗作用以及微生物间的资源竞争，而改变后定殖腐生分解者群落组成，从而影响整个凋落物分解过程，即优先定殖效应[4-5]。【前人研究进展】尽管国内外进行了一些初探研究，但仍然无法准确理解内源真菌在生态系统尤其在腐生系统中的功能地位。目前，对于内源真菌由共生系统转为腐生系统这一生态过程变化仅仅只是提出了一个概念，而没有真正的方法能够研究清楚。一项基于野外实验的真菌构建历史影响群落、生态系统的研究表明，即使在自然环境变化水平下，群落构建历史也会对生态系统功能产生强烈影响[6]。此外，这些群落构建的历史影响的强度已经被证明取决于捕食[7-9]、干扰[10]、生产力[8]、生态系统规模[11]和其他环境条件[12]。【本研究切入点】香樟是亚热带常绿阔叶林的生态优势树种之一，香樟人工林中植物群落以香樟乔木为主，生物量在90%以上，对其凋落物分解影响驱动力的研究对于区域碳循环过程具有重要的意义。【拟解决的关键问题】本研究选择亚热带地区具有代表性的人工林优势树种香樟（Cinnamomum camphora（L.）Presl.）凋落叶作为底物材料，通过模拟内源真菌参与的真菌群落组成，分析对后续凋落物分解过程的影响。

1 材料与方法

1.1 研究样地与采样

试验样地位于湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市（28°17'19″N，109°43'12″E），以吉首大学后山香樟人工林作为研究地。湘西地区气候属中亚热带季风湿润性气候，兼具大陆性气候，四季分明，春秋短、夏冬长，年平均温度16.7°C，年均降水量1 200～1 450 mm。湘西地区地形复杂，区域内森林植被资源丰富，亚热带地区常见阔叶树、针叶树、灌木以及草本植物在该地区均有广泛分布，具有亚热带山区植被的典型特征。

在试验样地随机选取5个10 m×10 m 的样方，将尼龙网挂在空中，落叶季节3—4月收集24小时内新凋落的香樟叶，戴无菌手套收集后用灭菌报纸包好放入自封袋中，自然晾干，然后用直径为1.5 cm 打孔器将香樟叶分成叶片直径为1.5 cm 的圆片，烘干，按每袋3 g的干质量分别装入锥形瓶中，最后用高压蒸汽灭菌锅灭菌，以便完全除去香樟叶内的微生物。

试验所用内源真菌、腐生真菌和菌根真菌均来源于实验室保存已有的菌种。其中，内源真菌基于其优势度分布状况筛选了3种优势菌，腐生真菌和菌根真菌均是在样地系统分离的常见菌种中采用随机方式进行选择。

1.2 试验设计

1.2.1 内源真菌参与的真菌群落构建 以6株不同腐生真菌构成的1种腐生菌群落为基本组成成分，用3 株内源真菌、1 株菌根真菌，设立空白对照组不加内源真菌（以研究内源真菌的影响），人工构建8 个真菌群落；以1株内源真菌为基本组成成分，分别用6株不同腐生真菌构成的3种不同腐生菌群落和1株菌根真菌人工构建6个真菌群落。共构建了14种真菌群落，构建情况表1所示。

表1 14种真菌群落的组成成分Tab.1 The composition of 14 fungal communities

1.2.2 香樟凋落物分解试验设计 在锥形瓶中放入10 g细河沙和3 g干质量的香樟凋落叶，高温高压完全灭菌后，接种10 mL内源真菌的菌悬液，放入培养箱培养7 d。然后依次接种10 mL腐生真菌和菌根真菌的菌悬液。凋落物分解周期为6个月，每3 个月取一次样，每次取7 个含有凋落叶的锥形瓶，依次测定凋落物干湿质量、凋落物呼吸速率（CO2释放量）及相应的微生物酶活性。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 干湿质量测定 锥形瓶中的样品先称量湿质量，后置于60 ℃恒温干燥箱中烘干至恒重，测定干质量[11]。

1.3.2 凋落物分解CO2释放量测定 微观空间的二氧化碳浓度为取样前后3 d 内，每隔2 h 测量一次，以估计累积3个月潜伏期的CO2释放量[14]。测量时，用红外线气体分析器的探头插入到锥形瓶中，测量CO2释放量[14]。

1.3.3 微生物酶活性测定 凋落物分解酶活性采用先提取粗酶液后用紫外可见分光光度计测定酶活性的方法：纤维素酶和淀粉酶的酶活性均采用二硝基水杨酸法测定[15-16]。木质素酶的酶活性采用邻联甲苯胺法测定[17]。酶活性均表示为μmol glucose g/h。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2010 软件对实验数据进行统计作图，用SPSS19.0 软件进行统计分析，数据表示为平均值±标准误。分别对前、后两时期不同处理之间的变量进行方差分析（采用Duncan 多重比较法分析两两之间的差异性，显著性水平设定为α=0.05）。为深入探讨不同真菌群落对后续凋落物分解过程的影响，运用R 软件（3.2.2）中的Vegan 包进行影响因素与响应变量关系的主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 香樟叶内源真菌的丰富度

由表2 可知，形态型PM01、PM02、PM03 分别为炭疽菌属（Colletotrichum）、烟管菌属（Bjerkandera）和炭角菌属（Colletotrichum），且这3种的相对丰富度较高，筛选出这3种作为优势内源真菌。

表2 香樟叶6种内源真菌丰富度Tab.2 Relative abundance of 6 species of endophytic fungi from Cinnamomum camphora leaves

2.2 群落构建对凋落物失重率的影响

整体来看，分解后期的失重率普遍高于分解前期（图1）。由于腐生真菌群落的不同，引起失重率提高最显著的，以群落F1 为主；由于内源真菌的不同，以真菌Ba 为主的真菌群落引起失重率的提高最显著。

图1 群落构建对香樟凋落物分解前期（a）和后期（b）失重率的影响Fig.1 The effects of community construction on the mass loss rate of Cinnamomum camphora litters at the former and later stages of litter decomposition

2.3 群落构建对凋落物分解CO2释放量的影响

在所有的真菌群落处理中，分解前期的呼吸速率明显高于分解后期（表3和表4）。在同一个分解时期中，由于腐生真菌群落的不同，引起累积CO2释放量最高的，分别以群落F1 为主；由于内源真菌的不同，以真菌Ba为主的真菌群落引起累积CO2释放量最高。

表3 以内源真菌（Ba）为基本组成成分的群落构建对凋落物分解在前期和后期24 h内累积CO2释放量的影响Tab.3 The effects of community construction with endophytic fungi（Ba）on the CO2 release from litter decomposition within 24 hours during the early and late stage %

表4 以腐生真菌群落（F1）为基本组成成分的群落构建对凋落物分解前期和后期24 h内累积CO2释放量的影响Tab.4 The effects of community construction with saprophytic fungi community（F1）on the CO2 release from litter decomposition within 24 hours during the early and late stage %

2.4 群落构建对凋落物分解酶活性的影响

不同真菌群落对凋落物分解的影响因分解时期的不同而出现差异性（图2）。Cx 酶在分解前期普遍高于分解后期；C1 酶在分解前期普遍低于分解后期。在分解前期中，由于腐生真菌群落的不同，引起Cx 酶和C1 酶的酶活性最高的，以群落F1 为主；由于内源真菌的不同，引起Cx 酶和C1 酶的酶活性最高的，以真菌Cf 为主（图2a 和图2c）。在分解后期中，由于腐生真菌群落的不同，引起Cx 酶和C1 酶的酶活性最高的，以群落F3 为主；由于内源真菌的不同，引起Cx 酶和C1 酶的酶活性最高的，以真菌Th 为主（图2b 和图2d）。

图2 群落构建对香樟凋落物分解前期（a，c）和后期（b，d）纤维素酶酶活性的影响Fig.2 The effects of community construction on the cellulase of Cinnamomum camphora litters at the former and later stages of litter decomposition

不同真菌群落对凋落物分解的影响因分解时期的不同而出现差异性（图3）。过氧化氢酶分解后期的酶活性明显高于分解前期；漆酶分解后期的酶活性普遍低于分解前期。在分解前期中，由于腐生真菌群落的不同，引起过氧化氢酶和漆酶的酶活性最高的，分别以群落F2 和F1 为主；由于内源真菌的不同，引起过氧化氢酶和漆酶的酶活性最高的，分别以对照组CK 和真菌Cf、Ba 为主（图3a 和图3c）。在分解后期中，由于腐生真菌群落的不同，引起过氧化氢酶和漆酶的酶活性最高的，以群落F2为主；由于内源真菌的不同，引起过氧化氢酶和漆酶的酶活性最高的，分别以对照组CK 和真菌Ba 为主（图3b 和图3d）。

图3 群落构建对香樟凋落物分解前期（a，c）和后期（b，d）木质素酶酶活性的影响Fig.3 The effects of community construction on the ligninase of Cinnamomum camphora litters at the former and later stages of litter decomposition

2.5 主成分（PCA）分析

在香樟凋落物分解前期和后期，PC1 分析分别解释了33.14%和22.80%的总方差，PC2 分别解释了19.56%和19.30%的总方差（图4）。

在分解前期，真菌Ba 与漆酶（laccase）、失重率（mass loss）、CO2释放量（CO2release）等变量关联性较大，均为正面影响；真菌Ba、Cf 与C1 酶（exo-1,4-β-glucanase）、Cx 酶（carboxymethyl cellulase）等酶活性关联性较大；真菌Th、群落F1 与过氧化氢酶（peroxidase）变量关联性较大，均为正面影响（图4A）。在分解后期，真菌Th 与C1酶、CO2释放量等变量关联性较大；真菌Ba 与失重率、漆酶、Cx 酶等变量关联性较大；群落F2、F3与过氧化氢酶活性关联性较大，均为正面影响（图4B）。

图4 群落构建后香樟凋落物在分解前期（A）和后期（B）失重率、CO2释放量及微生物酶活性的主成分分析Fig.4 Principal component analyses（PCA）of mass loss，CO2 release and associated microbial enzyme activities in degrading Cinnamomum camphora litters after community construction

3 讨论与结论

植物内源真菌从共生系统转为腐生系统的过程中，由于其本身优先定殖的独特性以及生活史的改变，对后续定殖的腐生真菌、菌根真菌可能产生拮抗作用，从而影响凋落物分解。结果表明，3 种不同内源真菌参与构建的真菌群落对凋落物分解的影响各不相同，真菌Ba（烟管菌）对失重率的影响和漆酶过氧化氢酶等木质素分解酶的影响一致，均具有明显促进作用。这可能是由于烟管菌作为一种常见的白腐真菌，是产漆酶的主要菌种，在木质素的分解过程中发挥了主要作用[18]。真菌在凋落物分解过程中扮演重要角色且凋落物分解是一个极其复杂的过程，需要多种真菌共同协调发生，因此，真菌群落组成的变化也同样与凋落物分解紧密相关[19]。群落F1（木霉菌+日本曲霉菌+叶鞘腐败菌+拟盘多毛孢菌+青霉菌+刺孢曲霉菌）在香樟凋落物分解过程中对失重率的影响显著提高，且菌根真菌Tp（牛肝菌）的加入导致凋落物分解加速。群落F1 中的青霉菌相比于群落F2（木霉菌+日本曲霉菌+叶鞘腐败菌+拟盘多毛孢菌+极细枝孢霉+刺孢曲霉菌）中的极细枝孢霉、群落F3（木霉菌+日本曲霉菌+叶鞘腐败菌+拟盘多毛孢菌+白囊耙齿菌+青霉菌）中的白囊耙齿菌，在其他真菌的作用下对凋落物分解的促进效应更具有优势，同时菌种之间相互联系增强了促进效应[20]。并且牛肝菌的加入提高了群落的多样性，使真菌群落对凋落物分解具有更加明显的效果[21]。真菌Cf（茶树炭角菌）对失重率的影响也显著提高，随着时间推移，6个月后的分解后期，对失重率的影响增强。可能是因为炭角菌具有分解凋落物中木质素和纤维素的强大能力，是凋落物叶分解最主要的物种之一[22]。

群落结构现在被认为是生态系统功能的关键决定因素[23]。群落构建历史，或在群落构建期间物种到达的顺序，可以影响物种的建立和群落结构，这些效应被称为构建历史效应，反过来又会影响群落和生态系统功能，包括生产力、分解和养分循环[12,24-25]。本研究中不同真菌群落对凋落物分解的影响因分解时期和真菌群落的不同而存在差异。分解酶是微生物活性的重要指标，是微生物分解的直接因素。然而，在大多数情况下，分解酶活性的差异规律与失重率的差异规律不完全一致，这可能是由于不同的分解酶对失重率的贡献并不完全一致。PCA 结果显示烟管菌Ba、毛栓菌Th、茶树炭角菌Cf 对香樟凋落物过程中各项酶活性指标的影响是显著提高的。这可能是由于内源真菌参与真菌群落构建对凋落物分解过程的影响存在一定的功能冗余[26]。另外，在内源真菌优先定殖完成后，可以为后续定殖的腐生菌以及菌根菌提供营养元素，促进了群落多样性，更利于凋落物的分解[21]。其次，在分解过程中，真菌群落的变化会导致凋落物的质量发生变化，与凋落物分解相关的微生物的活性也相应地发生变化，这些变化反映了真菌群落的分解代谢能力[27-28]。

目前对内源真菌的研究主要集中在内源真菌与植物体的共生关系方面[29]。随着研究的深入，研究者开始关注内源真菌在植物组织死亡后由共生系统进入腐生系统的生态效应，但是对于内源真菌在腐生系统中养分循环的生态学意义并不了解[30]。每一种进入凋落物分解过程的内源真菌都可能具有不同的功能作用，笔者的研究结果也显示在凋落物分解过程中不同的内源真菌参与构建的真菌群落对凋落物分解的影响具有差异性。研究结果发现不同的真菌群落构建在一定程度上影响凋落物分解及其酶活性。因此，论文显示了微生物群落组成在土壤碳循环过程中扮演了重要的角色，同时对真菌群落多样性影响凋落物分解过程具有一定的理论参考意义。