陈林玉，宋乐园，王云雨，卢梦如，顿彩云，杨青华，毕跃峰,*

（1.郑州大学药学院，河南 郑州 450001；2.河南农业大学农学院，河南 郑州 450046）

红酒谷（Panicum miliaceumL.）为禾本科狗尾草属植物红粟的种子，是稷的一种，外壳深红，去壳后称为红小米。红小米性温，味甘，具有活血化瘀、健脾暖胃、益气温中、消食之效。红小米作为河南省南阳盆地的特色农作物，营养丰富，种植及酿酒历史悠久，常用作南阳黄酒的酿造原料，使得南阳黄酒风味独特[1]，南阳因黄酒而入围“世界美酒特色产区”。此外，南阳红小米因油性较多，也可熬粥，为滋补佳品，固有“赛参汤”之美称。河南南阳地处伏牛山南麓，属于半干旱丘陵地带，非常适宜红酒谷的生长，目前，河南南阳各级政府积极利用现代科技帮助种植户提高种植效益，提升红酒谷黄酒品质。但鲜见对红小米营养功效成分系统研究的报道，本实验从红小米中分离得到5 个化合物，定性定量地检测红小米中蛋白质、氨基酸、脂肪酸、微量元素等营养成分，对南阳红小米品质进行综合分析和评价，旨在为河南省南阳红小米的质量标准建立和进一步开发利用提供参考，为阐明南阳红小米黄酒的独特功效提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2017年南阳红小米（HXM-1）、2018年南阳红小米（HXM-2），产自河南省南阳市红小米种植基地；小米产地河南郑州。

芹菜素 中国药品生物制品检定研究院；石油醚（分析纯） 天津市风船化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

JHBE-50A闪式提取器 河南金鼐科技发展有限公司；JBIT5374-1991天平 上海奥豪斯仪器有限公司；RE52-AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；KQ5200E超声清洗机 昆山市超声仪器有限公司；DHG-9240A烘箱 上海精宏实验设备有限公司；XMTD-4000恒温水浴锅 北京市永光明医疗器械有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计、Lambda 35紫外-分光光度计 日本岛津公司；L8900氨基酸分析仪日本日立集团；WZZ-2S数字式旋光仪、K1100F自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司；Rrodigy电感耦合等离子体发射光谱仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；RF-5301PC荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司；e2965高效液相色谱仪 上海沃特斯智能科技有限公司；7890A气相色谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；硅胶柱色谱（110 cm×20 cm，37 μm）青岛邦德高新技术材料有限公司；Sephadex LH-20色谱柱（90 cm×10 cm，40 μm） 美国GE公司；ODS柱色谱（90 cm×16 cm，10 μm） 北京绿百草科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 红小米提取分离

取红小米1 kg，10 倍量的体积分数80%乙醇溶液浸泡30 min。闪式提取器破碎提取3 min，静置10 min后用8 层纱布过滤，此操作重复3 次，合并滤液，55 ℃减压浓缩后转移到蒸发皿中24 h蒸干，得红小米总浸膏305.5 g，得膏率为30.55%，避光冷藏。

取180 g的红小米浸膏，蒸馏水溶解至密度为1.1 g/cm3，转移至5 L的分液漏斗中，石油醚萃取5 次之后，再使用乙酸乙酯萃取5 次，将萃取液于55 ℃减压浓缩，得35 g石油醚萃取物油状浸膏（RM-A），12 g乙酸乙酯萃取物固体浸膏（RM-B）。

取RM-A经硅胶柱色谱（110 cm×20 cm，37 μm），用石油醚-二氯甲烷（20∶1、10∶1、1∶1、1∶10，V/V）梯度洗脱，合并相同成分，55 ℃减压蒸馏至浸膏状，得到5 个组分Fr.1～Fr.5。选择Fr.3（7.5 g）用硅胶柱色谱石油醚-二氯甲烷（6∶1、3∶1、1∶3，V/V），连续2 次使用ODS柱色谱（甲醇-水（100∶1，V/V））、重结晶得到化合物1（40.24 mg）；使用硅胶柱色谱二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶3∶1，V/V）及重结晶得化合物2（18.76 mg）；经硅胶柱色谱石油醚-二氯甲烷（4∶1），得到化合物4（100.17 mg）。取RM-B经ODS柱色谱，用甲醇-水（100∶1，V/V）梯度洗脱，约15 mL收集一次液体，将收集的液体通过薄层色谱法进行检识，合并斑点相同的成分后，55 ℃减压蒸馏至浸膏状，得到7 个组分Fr.6～Fr.12。选择Fr.8（3.6 g）用硅胶柱色谱梯度洗脱（二氯甲烷-乙酸乙酯系统），连续3 次使用硅胶柱色谱分离，Sephadex LH-20色谱柱分离、二氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）洗脱15 mL收集一次液体，得到化合物3（28.68 mg）；连续2 次使用硅胶柱色谱石油醚-乙酸乙酯-甲醇（13∶7∶2，V/V）及重结晶，得到化合物5（13.95 mg）。

1.3.2 单体化合物的结构鉴定

结构鉴定前用薄层色谱进行纯度检测，利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）（1H-NMR：400 MHz、13C-NMR：100 MHz）和质谱数据解析结构，与文献[2-12]数据对照，确证化合物结构。

1.3.3 红小米总黄酮含量测定

取10 mg芹菜素于100 mL容量瓶中，体积分数70%乙醇溶液定容，得质量浓度0.1 mg/mL芹菜素对照品溶液。

供试品溶液的配制：取红小米总浸膏100.6 mg于10 mL容量瓶中，70%乙醇溶液定容，得质量浓度10.6 mg/mL供试品溶液。

取对照品溶液1 mL、供试品溶液3 mL，分别置于25 mL容量瓶中，依次加入5 mL 70%乙醇溶液、1 mL质量分数5% NaNO2溶液，摇匀，暗处静置6 min，加入1 mL质量分数10% Al(NO3)3溶液，避光、室温静置6 min，加入10 mL质量分数4% NaOH溶液，用70%乙醇溶液定容，摇匀，暗处静置15 min，于300～500 nm波长范围内扫描。

亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法[13]测定含量：分别取对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于25 mL容量瓶中，按上述选择测定波长方法依次加入各试剂，于359 nm处测定吸光度。

1.3.4 营养成分测定

氨基酸测定：GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》；色氨酸测定：NY/T 57—1987《谷物籽粒色氨酸测定法》；蛋白质测定：GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》；粗淀粉测定：NY/T 11—1985《谷物籽粒粗淀粉测定法》；脂肪酸测定：GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》；VA、VD、VE测定：GB 5009.82—2016《食品中维生素A、D、E的测定》；VB1测定：GB 5009.84—2016《食品中维生素B1的测定》；VB2测定：GB 5009.85—2016《食品中维生素B2的测定》；微量元素锌、铁、锰、镁测定：GB 5009.268—2016《食品中多元素的测定》；微量元素磷测定：GB 5009.87—2016《食品中磷的测定》；微量元素硒测定：GB 5009.93—2017《食品中硒的测定》。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

化合物1，淡黄色结晶，熔点为113～116 ℃，三氯化铁-铁氰化钾显色为蓝色，提示该物质为酚类物质。电喷雾串联质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）m/z152 [M+H]+，分子式为C8H8O3。如图1A所示，1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.83（s，1H，H-CHO)，6.17（s，1H，OH），7.05（d，1H，J＝8.5 Hz，H-5），7.43（d，2H，J＝5.5 Hz，H-2，H-6），3.97（s，3H，H-OCH3）。如图1B所示，13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：190.9（C-CHO），151.7（C-4），147.2（C-3），129.9（C-1），127.6（C-6），114.4（C-5），108.8（C-2），56.1（C-OCH3）。氢谱中9.83是位于低场的单峰，活泼氢，为醛基氢；δ3.97为3 个氢的单峰，提示为甲基。上述数据与李林珍[2]和王知斌[3]等的数据基本一致，鉴定化合物1是香草醛（图1C）。

图1 香草醛的结构鉴定图Fig.1 Structural characterization of vanillin

化合物2，白色结晶，熔点为208～210 ℃，溴酚蓝与三氯化铁-铁氰化钾均显阳性，该化合物为酚酸类。EI-MSm/z167 [M-H]-，分子式为C8H8O4。如图2A所示，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.67（d，1H，J＝3.2 Hz，H-6），7.65（m，1H，H-2），6.99（d，1H，J＝8.0 Hz，H-5），3.90（s，3H，H-OCH3）。如图2B所示，13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：170.2（C-COOH），152.8（C-4），148.8（C-3），125.4（C-6），123.2（C-1），116.0（C-5），113.9（C-2），56.5（C-OCH3）。氢谱δ7.67、7.65、6.99为典型的ABX偶合系统，推测为苯环上的3 个质子信号。δ3.90推测为与吸电子基相连的甲基。数据与朱伶俐[4]和谢威[5]等的结果基本一致，鉴定化合物2为香草酸（图2C）。

图2 香草酸的结构鉴定图Fig.2 Structural characterization of vanillic acid

化合物3，白色结晶，熔点为136～140 ℃，硫酸-乙醇和香草醛-硫酸显色呈紫红色斑点。EI-MSm/z414（M+），分子式为C29H50O。如图3A所示，1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.36（d，1H，J＝5.3 Hz，H-6），3.57～3.49（m，1H，H-3），2.33～2.20（m，2H，H-4、7），1.02（s，3H，H-19），0.93（d，3H，J＝6.4 Hz，H-21），0.86（d，3H，d，J＝8 Hz，H-29），0.83（d，3H，J＝2 Hz，H-26），0.81（s，3H，H-27），0.69（s，3H，H-18）。如图3B所示，13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：140.8（C-5），121.7（C-6），71.8（C-3），56.8（C-14），56.1（C-17），50.2（C-9），45.9（C-4），42.4（C-13），42.3（C-24），39.8（C-12），37.3（C-1），36.5（C-10），36.2（C-20），34.0（C-7），31.9（C-8），31.9（C-22），31.7（C-2），29.2（C-25），28.3（C-16），26.1（C-28），24.3（C-15），23.1（C-23），21.1（C-11），19.8（C-26），19.4（C-19），19.1（C-27），18.8（C-21），12.0（C-29），11.9（C-18）。氢谱中显示有6 个甲基信号峰，其中δ0.70（s，3H）和δ1.02（s，3H）是典型的甾醇18-CH3和19-CH3的质子信号；且δ5.36（d，1H）为烯氢质子信号，结合碳谱中δ140.8和δ121.7为分子中5 位和6 位双键的存在。数据与Gomes[6]和孙珍[7]等的结果基本一致，确定化合物3为β-谷甾醇（图3C）。

图3 β-谷甾醇的结构鉴定图Fig.3 Structural characterization of β-sitosterol

化合物4，油状液体，熔点为-35 ℃，ESI-MSm/z279[M+H]+，分子式为C16H22O4。如图4A所示，1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.71（dd，2H，H-3、6），7.52（dd，2H，H-4、5），4.32（t，4H，J＝6.8 Hz，H-1′、1′′），1.70（m，4H，H-2′、2′′），1.43（q，4H，J＝7.6、11.2 Hz，H-3′、3′′），0.95（t，6H，J＝7.2 Hz，H-4′、4′′）。如图4B所示，13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：167.8（C-7、8），132.5（C-1、2），131.1（C-4、5），129.0（C-3、6），65.7（C-1′、1′′），30.7（C-2′、2′′），19.3（C-3′、3′′），13.9（C-4′、4′′）。氢谱中δ7.71、7.52提示为苯环邻位取代，而且取代基团相同，故苯环上的4 个质子构成AA′XX′系统。以上数据与高昊[8]和石绍淮[9]等的结果基本一致，化合物4鉴定为邻苯二甲酸二丁酯（图4C）。

图4 邻苯二甲酸二丁酯的结构鉴定图Fig.4 Structural characterization of dibutyl phthalate

化合物5，黄色结晶，熔点为300 ℃，盐酸-镁粉反应呈红色，推测为黄酮类化合物。ESI-MSm/z269[M-H]-，分子式为C15H10O5。如图5A所示，1H-NMR（400 MHz，DMSO-D6）δ：12.96（1H，s，H-5），10.59 （2H，d，J＝190.1 Hz，H-7），7.92（d，2H，J＝11.6 Hz，H-2′、6′），6.92（d，2H，J＝12.0 Hz，H-3′、5′），6.78（s，1H，H-3），6.48（d，1H，J＝2.4 Hz，H-8），6.19（d，1H，J＝2.4 Hz，H-6）。如图5B所示，13C-NMR（100 MHz，DMSO-D6）δ：181.7（C-4），164.2（C-2），163.8（C-7），161.4（C-9），161.2（C-4′），157.3（C-5），128.5（C-2′、6′），121.1（C-1′），116.0（C-3′、5′），103.7（C-10），102.8（C-3），98.8（C-6），94.0（C-8）。氢谱中δ7.92（d，2H）和δ6.92（d，2H）提示B环可能为AA′BB′系统；δ6.78（s，1H）为黄酮类化合物三位氢质子的特征信号；δ6.48（d，1H）、6.19（d，1H）为A环质子信号，提示A环为5,7-二取代。数据与文献[10-12]的结果基本一致，鉴定化合物5为芹菜素（图5C）。

图5 芹菜素的结构鉴定图Fig.5 Structural characterization of apigenin

2.2 红小米总黄酮测定

2.2.1 波长的测定结果

对照品及供试品均在359 nm波长处有最大吸收，故选择359 nm为总黄酮的测定波长，见图6。

图6 供试品、对照品的波长扫描Fig.6 Ultraviolet absorption spectra of test and reference samples

2.2.2 线性关系测定结果

亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法测定黄酮含量，得线性方程Y=0.069 6X+0.000 1，R2=0.999 6，结果表明芹菜素在质量浓度2～12 μg/mL线性关系良好。

2.2.3 精密度实验

吸取0.3 mL供试品溶液于25 mL容量瓶，显色后，测定吸光度，重复操作6 次，平均吸光度为0.434 4±0.003 4，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.788 6%。

2.2.4 稳定性实验

吸取供试品溶液0.3 mL于25 mL容量瓶，显色后分别于15、25、35、45、55、65、75 min测定吸光度，平均吸光度为0.431 7±0.004 5，RSD为0.969 9%。

2.2.5 重复性实验

分别称取6 份同一批次红小米浸膏，各100.6 mg，编号1～6，置于10 mL容量瓶，用70%乙醇溶液定容，得10.6 mg/mL的供试品溶液。分别吸取0.3 mL供试品溶液，显色后测得吸光度为0.431 6±0.007 2，RSD为1.522 9%。

2.2.6 回收率实验

分别吸取供试品溶液6 份各0.1 mL于25 mL容量瓶中，分别加入对照品溶液0.6 mL，显色后测定吸光度，平均回收率为（99.79±1.59）%，RSD为1.167%。

2.2.7 样品测定

吸取供试品溶液0.3 mL于25 mL容量瓶中，显色后吸光度为0.434 9±0.001 4，计算得知红小米浸膏的总黄酮质量分数为4.91%。

2.3 营养成分分析

2.3.1 一般营养成分分析

红小米的营养物质及其含量如表1所示，其中蛋白质、脂肪含量均高于中国食物成分表[14-15]的小米；红小米的粗淀粉、水分含量低于中国食物成分表[14-15]的小米，其中淀粉含量低可能是红小米出酒率偏低的一个原因（出酒质量比为1∶1.2）。

表1 红小米与小米中一般营养成分含量对比Table 1 Comparison of proximate nutrient contents in red millet and common millet%

2.3.2 氨基酸的成分及分析

由表2可知，南阳红小米中氨基酸含量丰富，共检测出17 种氨基酸，其中包含赖氨酸、精氨酸和组氨酸3 种碱性氨基酸，天冬氨基酸和谷氨酸2 种酸性氨基酸。同一产地不同年份红小米中氨基酸含量相差不大，对比HXM-1的17 种氨基酸，含量相对较高的有谷氨酸达到2.32%，其次为亮氨酸达到1.48%；含量较低的有酪氨酸0.12%、蛋氨酸0.20%、色氨酸0.11%。谷氨酸在生物体内蛋白代谢过程中占重要地位，临床应用中，谷氨酸多用于治疗肝性昏迷和改善儿童智力发育。亮氨酸参与调节氨基酸与蛋白质代谢，调节血糖水平，此外能够维持危重病人的营养需求[16-17]。

表2 红小米与小米中氨基酸含量对比Table 2 Comparison of amino acid contents in red millet and common millet%

优质蛋白质具备理想的必需氨基酸数量及含量，其必需氨基酸（essential amino acid，EAA）、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）、总氨基酸（total amino acids，TAA）间的比例也需保持平衡[18]。红小米中氨基酸总量为10.66%，8 种EAA总量为4.21%，EAA-TAA、EAA-NEAA分别为39.49%、60.51%。根据联合国粮农组织及世界卫生组织（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）的理想模式[19]，质量较好的蛋白质其组成氨基酸EAA-TAA为40%左右、EAA-NEAA在60%以上，说明南阳红小米中氨基酸组成较接近FAO/WHO的理想模式[20-21]。

2.3.3 脂肪酸的组成及分析

由表3可知，南阳红小米测出9 种脂肪酸（4 种饱和脂肪酸、5 种不饱和脂肪）。检出饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的16.26%，其中主要是棕榈酸（7.94%）和硬脂酸（5.78%），还有少量的山嵛酸、花生酸等。HXM-1不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的83.74%，特别是亚油酸含量最高（64.60%），其次是油酸（11.80%），还有少量的油酸、棕榈油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸等。亚油酸是人体的必需脂肪酸，具有降血脂、降血压以及防治心脑血管疾病等功能，具有调节机体代谢的作用[22-23]。α-亚麻酸是人体转化合成二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docose hexaenoic acid，DHA）的前体物质，而EPA、DHA具有开发智力、保护视力、降血压、降血脂，预防肿瘤、乳腺癌、动脉粥样硬化等作用[24]。γ-亚麻酸具有降血脂、调节血压和胆固醇合成的功效，可用于心血管疾病的预防和治疗，因其良好的抗氧化活性，也具有美白和抗皮肤老化等作用[25]。

表3 红小米与小米中脂肪酸成分含量对比Table 3 Comparison of fatty acid contents in red millet and common millet%

与小米脂肪酸对比，南阳红小米的α-亚麻酸和γ-亚麻酸含量明显高于小米，硬脂酸和花生酸略高于普通小米[26]；南阳红小米中除棕榈酸和油酸的含量略低于墨脱红米，其他脂肪酸含量均高于墨脱红米[27]。

2.3.4 维生素的组成及分析

南阳红小米中VB1、VB2、α-VE、γ-VE和δ-VE的含量见表4，其中含量最高的是γ-VE，为2.24 mg/100 g。

表4 红小米与小米中维生素含量对比Table 4 Comparison of vitamin contents in red millet and common millet mg/100 g

经查阅《中国食物成分表》[14]和张超等[26]的研究发现，南阳红小米中VB1和VB2略低于小米，但α-VE、γ-VE和δ-VE均高于小米。不同产地小米的脂溶性维生素含量相差较大，南阳红小米α-VE含量高于哈尔滨和延安[14]小米的含量；γ-VE的含量和延安小米相比含量相近，高于哈尔滨、青岛小米和陕西红米的含量[27]；δ-VE的含量和其他小米相比含量偏高。VE对人体有重要的生理功能，具有抗衰老、提高免疫力等作用，对生殖功能、细胞代谢均有影响[28]。

2.3.5 微量元素的组成及分析

由表5可知，南阳红小米检测出6 种微量元素，其中HXM-1的Mg和P含量最高，分别为2 160、3 470 mg/kg。与小米所含微量元素比较发现，南阳红小米中微量元素Zn、Fe、Mn、Mg、P的含量偏高，Se元素的含量略低于其他产地小米。Mg可降血压，预防动脉粥样硬化的形成，改善心肌缺血，减轻心脏负荷，Mg还可逆转洋地黄中毒引起的心律失常[29]；P是细胞缓冲体系的重要组成成分，且磷酸盐参与多种酶促反应。Fe含量较高，为283 mg/kg，是构成血红蛋白的必需元素，因此可作为预防缺铁性贫血的食物。南阳红小米还含有少量的Se，具有预防心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗病毒、防癌、保护视力、免疫调节的功效[30-31]。

表5 红小米与小米中微量元素含量对比Table 5 Comparison of microelement contents in red millet and common millet mg/kg

3 结 论

本实验对红小米中化学成分进行研究，得到香草醛、香草酸、β-谷甾醇、邻苯二甲酸二丁酯及芹菜素共5 个化合物，均为首次从该植物中分离得到。以芹菜素为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法测得红小米中总黄酮质量分数为4.91%。该方法科学、方便、重现性好。通过对红小米化学成分的研究，为其质量标准研究提供科学依据。系统测定南阳红小米中蛋白质、脂肪、水分、粗淀粉、氨基酸、脂肪酸、维生素及微量元素等营养成分的含量，发现南阳红小米营养成分种类多样且含量丰富，氨基酸组成接近FAO/WHO的理想模式，防治心脑血管相关疾病的亚油酸含量很高，影响人类生殖功能和细胞代谢等的γ-VE及微量元素Mg和P含量均较高，整体系统地阐明南阳红小米独特的营养价值，并对比2017、2018年的南阳红小米营养成发现两年间的红小米营养成分含量比较接近，因此红小米在2017、2018年质量保持稳定。本实验研究南阳红小米的化学成分和营养成分，为南阳道地产品质量标准方法的建立提供参考，为进一步开发南阳红小米进一步开发及研究南阳特色红小米黄酒的营养功效价值提供理论依据。