王运九 孙健 李玲霞 郭金虎 张珏

【关键词】肝细胞癌;微核糖核酸-190;细胞因子信号转导抑制因子5;增殖

肝细胞癌（HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症死亡的第二大原因，占原发性肝癌的80%，严重威胁人类健康[1-2]。随着对HCC分子生物学研究的不断深入，已鉴定出与该疾病有关的不同基因和途径。为了更好地理解HCC发生、发展的分子机制，亟待发现更精准的预后标志物及有效的治疗策略。张春艳等（2016年）认为作为一类非编码单链RNA分子，微RNA（miR）与肝癌的发生、发展过程密切相关。miR-144的高表达可明显抑制裸鼠肝癌形成[3]。近期研究表明，miR-190可以通过抑制ZEB2的表达来抑制胶质瘤细胞的生长和迁移[4]。然而，miR-190在HCC中的表达、潜在作用和机制仍不清楚。本研究探讨miR-190通过调控细胞因子信号转导抑制因子5（SOCS5）参与HCC发生与发展过程的关键作用与机制。

材料与方法

一、研究对象

选取2019年5月至2019年12月在上海中医药大学附属曙光医院接受手术切除且病理确诊为HCC的患者84例，其中男58例、女26例，年龄（63±5）岁。收集HCC癌组织及对应的癌旁组织（距肿瘤边缘≥2cm）。患者均签署知情同意书，研究方案经上海中医药大学附属曙光医院伦理委员会审核通过。

二、细胞、动物及主要试剂

SNU398和HepG2细胞均购于中国科学院上海细胞研究所。24只雌性无胸腺裸鼠，4～6周龄，购自中国医学科学院实验动物中心。SOCS5、β-actin抗体购自Sigma公司;miR-190模拟物/抑制物和Dharmafect1购自Dharmacon公司;靶向SOCS5的psiCHECK-2载体购自上海联迈生物工程有限公司;Lipofectamine3000转染试剂、TRIzol试剂、miR定量试剂盒购自ThermoFisherScientific公司;Transwell小室购自Corning公司;Mgteigel基质胶购自BD公司。

三、细胞培养与转染

SNU398和HepG2细胞分别用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640或DMEM培养基于5%CO2、37°C恒温培养箱中培养。在转染前将细胞接种于12孔板中，待细胞达到每孔150000个细胞的密度时，根据说明书将miR-190模拟物/抑制物或SOCS5siRNA（siSOCS5）及各自的阴性对照（模拟物NC/抑制物NC或siNC）分别用Dharmafect1和Lipofectamine3000转染至细胞。

四、细胞活力

根据细胞计数试剂盒（CCK-8）说明书测定细胞活力。将转染细胞按1×103个/孔接种于96孔板，每孔加入10μlCCK-8溶液，在37℃下孵育2h。用酶标仪检测450nm波长下细胞的吸光度。

五、Transwell侵袭与迁移实验

取100μl基质胶稀释液铺于Transwell小室上室，含胎牛血清的常规培养基加入下室，细胞置于37℃、5%CO2培養箱内继续培养24h。擦去上室细胞与基质胶，4%多聚甲醛固定，1%结晶紫染色，显微镜下观察并计算侵袭细胞数。迁移实验无需铺胶，其余操作同侵袭实验。

六、裸鼠异种移植肿瘤

于裸鼠腹侧皮下接种1.5×106个用siNC或siSOCS5转染的SNU398或HepG2细胞。对肿瘤生长进行长达18d的监测，并通过以下公式计算肿瘤体积：体积=（L×W2）/2，其中L为肿瘤的长度，W为肿瘤的宽度。

七、RNA提取和实时荧光定量PCR（RT-PCR）

采用TRIzol法提取HCC组织、癌旁组织、转染后的SNU398或HepG2细胞中的总RNA。根据miR逆转录试剂盒说明书进行逆转录，随后，使用7900HT快速实时PCR系统（ThermoFisherScientific）进行RT-PCR。miR-190以U6为内参，SOCS5以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt方法计算结果。引物序列见表1。

八、蛋白免疫印迹法

利用RIPA裂解液提取细胞蛋白，并用Bradford法测定蛋白质浓度。将10μg总蛋白上样后，进行SDS-PAGE电泳，并转移至PVDF膜上。封闭2h后，加入SOCS5抗体（1∶1000）或β-actin抗体（1∶2000），4℃孵育过夜。TBST冲洗3次后，加入二抗，室温孵育lh，洗膜后用ECL化学发光试剂盒显影。

九、荧光素酶测定

构建野生型和突变型基因靶点SOCS5的3′UTR-荧光素酶表达载体（SOCS5-Wt和SOCS5-Mut），使用Lipofectamine3000将其与miR-190模拟物和阴性对照同时分别转染。转染72h后，使用双荧光素酶报告系统（上海吉马生物制药有限公司）连续测量萤火虫-海肾荧光素酶的活性。

十、统计学处理

应用GraphPadPrism8.0分析数据，正态分布定量资料以表示，定性资料以例表示。采用配对t检验分析癌组织和癌旁组织间的差异，独立样本t检验分析体外定量数据，两因素重复测量方差分析转染时间与分组间的差异，χ2检验分析miR-190表达与临床特征的关系。生存曲线采用Kaplan-Meier法，log-rank检验进行比较。α=0.05。

结果

一、miR-190是HCC中潜在的癌基因

与来自同一HCC患者的癌旁组织相比，HCC癌组织中miR-190水平上调（t=6.849，P<0.001，图1A）。将84例HCC组织以miR-190的中位表达水平分为高表达组（>中位数，40例）和低表达组（≤中位数，44例），分析miR-190的表达量与HCC患者临床特征的关系。结果显示，miR-190的表达量与肿瘤大小、淋巴结转移和临床分期有关（P均<0.05），见表2。

miR的高水平与HCC患者的预后不良有关（HR=0.656，95%CI0.352～0.933，P=0.027，图1B）。miR-190的过表达提高SNU398和HepG2细胞的体外增殖能力（t=4.465，P<0.001;t=2.824，P=0.005，图1C）。

二、下调miR-190的表达抑制肝癌细胞侵袭及迁移能力

下调miR-190处理SNU398和HepG2肝癌细胞后，发现下调miR-190的表达抑制了肝癌细胞的侵袭（t=13.120，P<0.001;t=7.398，P=0.002）及迁移能力（t=5.587，P=0.005;t=4.082，P=0.015），见图2。

三、miR-190直接靶向SOCS5

借助生物信息学数据库StarBase3.0对miR-190的靶基因进行预测，发现SOCS5可能是miR190的潜在靶点（图3A）。为了验证该假设，我们通过RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测了miR-190对SOCS5转录和蛋白质水平的影响。结果显示，miR-190的过表达导致SNU398和HepG2细胞中SOCS5mRNA（t=3.212，P=0.033;t=3.597，P=0.023，图3B）和蛋白（t=2.895，P=0.044;t=2.813，P=0.048，图3D）表达减少，而抑制miR-190导致SOCS5mRNA（t=8.249，P=0.001;t=3.865，P=0.018，图3C）和蛋白表达（t=3.098，P=0.036;t=8.835，P=0.001，图3E）的增加。

当miR-190与SOCS5-Wt共同转染到SNU398细胞中时，荧光素酶活性下降（t=5.983，P=0.004），SOCS53UTR结构中的点突变可消除这种效应（t=0.676，P=0.536，图3F）。在HepG2细胞中也获得了类似的结果（图3G）。

四、SOCS5是HCC的肿瘤抑制因子

靶向siRNA可有效下调SNU398和HepG2细胞中的SOCS5水平（t=3.342，P=0.028;t=9.887，P=0.001，圖4A）。

在体外，两因素重复测量方差分析显示SNU398和HepG2细胞的增殖随时间变化呈上升趋势（F时间=277.7和233.3，P均<0.001，图4B），siSOCS5组增殖能力高于siNC组（F组间=36.6和34.2，P均<0.001），分组与时间有交互效应（F=15.4和9.656，P均<0.001）。此外，转染siSOCS5的细胞迁移（t=2.946，P=0.042;t=7.258，P=0.002）和侵袭能力（t=2.876，P=0.045;t=8.764，P=0.001）均增强（图4C）。我们在异种移植肿瘤模型中进一步评估了SOCS5基因敲除对HCC细胞肿瘤发展过程中的作用。与阴性对照相比，SOCS5基因敲除导致SNU398和HepG2细胞的异种移植肿瘤体积（t=2.829，P=0.047）和质量（t=7.635，P=0.002）增加（图4D）。

讨论

Xue等（2016年）研究显示，HCC是癌症相关死亡的第二大原因，分子异质性的存在和生物标志物的缺失可导致晚期患者预后不良，从而影响癌症的治疗效果。因此，寻找预后标志物及新的分子靶点是该疾病面临的主要挑战之一。miR在肿瘤分类和预后方面发挥重要作用，其异常的表达可作为肝癌的标志。近年来，大量研究在肝癌中发现了与肝癌风险增加、肿瘤发生发展、晚期和血管浸润相关的miR信号，并将miR作为治疗靶标[1，3]。

有研究显示在侵袭性神经母细胞瘤和前列腺癌中miR-190表达减少，而在快速生长的肿瘤中其过度表达会抑制肿瘤生长和转移，miR-190还调节上皮间质转化抑制乳腺癌转移[5]。相反，Jia等（2016年）研究显示miR-190在胃癌组织中表达上调，并促进胃癌的进展。这提示miR-190可能在不同的肿瘤环境和肿瘤发展的不同阶段发挥不同的作用。而关于miR-190在肝癌中的作用的研究目前较少，如Hung等（2014年）发现miR-190b的上调对诱导人HCC胰岛素抵抗的IGF-1降低起作用。本研究首先发现miR-190在HCC肿瘤中上调，且miR-190高表达与HCC患者的不良预后有关，提示其可能在HCC发展过程中起促进作用。此外，我们检测了miR-190过表达对HCC细胞生长的影响，结果发现miR-190过表达能促进细胞增殖，而下调miR-190抑制了肝癌细胞的侵袭及迁移能力，表明miR-190通过促进HCC细胞增殖、侵袭和迁移等来发挥其促癌作用。这些结果与在胃癌中的观察结果相一致。

当miR-190过表达时，SOCS5在HCC细胞系中下调，由此我们推测SOCS5是miR-190的潜在靶点。SOCS5在人类癌症中的作用已被研究，在前列腺癌和肝癌中已经检测到SOCS5的下调[6]。据报道，抑制miR-18a-5p促进SOCS5而诱导骨肉瘤细胞凋亡[7]。随后，我们使用荧光素酶检测法证明了它确实是miR-190的靶点，同时，miR-190还能调节其转录和蛋白水平。有趣的是，SOCS基因是JAK/STAT通路中负反馈回路的一部分[8]。众所周知，JAK/STAT途径可激活细胞的增殖、迁移、分化、凋亡以及抑制剂的失调，导致包括肝癌在内的人类疾病[9]。Yuan等[10]研究发现，miR-30a靶向SOCS-1，并通过JAK/STAT信号通路抑制脓毒症大鼠的肝细胞增殖和促进细胞凋亡。Wang等[11]发现了板蓝根多糖通过激活JAK/STAT信号通路来发挥对HBV的体外抗病毒作用。考虑到目前SOCS5与肝癌的相关研究较少，我们进行了额外实验来验证SOCS5在肝癌中的作用，结果证明了SOCS5在体内和体外都可作为HCC的肿瘤抑制因子。以上结果表明，在HCC中，由miR-190介导的SOCS5下调将导致JAK/STAT通路的激活，进而促进细胞增殖、侵袭和迁移。有研究报道miR-885-5p上调通过靶向抑制SOCS5促进大肠癌细胞增殖和迁移，我们的研究结果与其一致[12]。

综上所述，我们验证了细胞因子家族抑制因子之一的SOCS5作为miR-190在肝癌中的真实靶点，并证明了SOCS5在肝癌中的抑瘤作用。此外，我们强调了miR190的抑制作用在恢复SOCS5水平方面的潜在用途，从而降低肝癌细胞的致瘤特性。这项研究强调了miR-190在肝癌研究中的重要性，不仅是作为潜在的生物标志物，而且有可能成为待开发潜在药物的新的分子靶标。