张森林，孙旭东，吕久利

(博爱新开源医疗科技集团股份有限公司 研发中心，河南 焦作 454450)

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一种广泛使用的水溶性高分子材料，自从被德国化学家Reppe发明以来，逐渐在医药、化妆品、食品、酿造、黏结、环保、电池、聚合物合成等领域得到广泛应用[1-6]。PVP按照相对分子质量大小可以分为K17、K30、K60、K85、K90等多种产品，其相对分子质量大小及其分布对其应用性能有重要影响，工业上常采用的黏度法只能测得黏均相对分子质量Mv，得不到相对分子质量分布的信息，而且操作步骤繁琐、误差较大。其他测量相对分子质量的方法如渗透压法、光散射法、超速离心等方法只能得到单独的相对分子质量信息而不能获得相对分子质量分布的信息。

凝胶渗透色谱法(GPC)，是简便测得多种相对分子质量及其分布的有效方法。目前有机体系的GPC分析已经非常成熟，特别是Benoit普适校正方法建立之后，该方法已经成为表征高聚物相对分子质量及其分子结构的一种强有力的手段[7]。因为PVP在多种有机溶剂中具有良好的溶解性，国内外研究者多采用有机溶剂为流动相配合添加一定量的盐类物质来改善PVP与色谱柱之间的相互作用，最终测得的相对分子质量误差较大[8-10]。而采用水作为流动相进行GPC分析往往存在非体积排除效应，因而采用水溶性GPC测试PVP相对分子质量的研究很少见诸报道[11-15]。

本文采用水溶性GPC设备，以两根Shodex Ohpak SB-806M HQ(固定相为羟甲基丙烯酸酯凝胶)串联作为色谱柱组，考察了流动相对非体积效应的影响，利用聚氧乙烯(PEO)/聚乙烯醇(PEO)标样结合普适矫正方法实现了高相对分子质量PVP在水溶性GPC上的相对分子质量分析，对分析方法的重复性进行了验证，所得的方法有良好的参考价值，有利于在检测实验室中进行推广。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

PEO/PEG标准品，峰顶(Mp)相对分子质量分别为1 370 000、610 000、260 700、104 700、37 100、12 500、4 300、600，Mw/Mn=1.05～1.10，上海子起生物科技有限公司；K17、K30、K60、K85、K90，博爱新开源医疗科技集团股份有限公司；BASF K85，德国巴斯夫化学品公司；超纯水由Millipore超纯水离子交换器制得；甲醇，色谱纯，德国Merck公司；硝酸钠，分析纯，阿拉丁试剂公司；无水磷酸二氢钾，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；无水磷酸氢二钠，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

Ultimate 3000凝胶色谱色谱系统：DGP-3600SD泵，WPS-3000(RS)自动进样器，TCC-3x00(RS)柱温箱，ERC RefractoMax520 RI检测器，变色龙7.2.9色谱工作站，美国Thermo Fisher公司；千谱HW2000色谱工作站，上海峰谱软件有限公司；Shodex OHpak SB-806M HQ凝胶色谱柱(8×300 mm，粒径13 μm，孔径1.5×103nm)，SB-G保护柱(6×50 mm，粒径10 μm)，日本Shodex公司。

1.2 方法

1.2.1色谱条件

两根Shodex OHpak SB-806M HQ串联，柱前加SB-G保护柱；流动相，0～0.3 mol/L LiNO3的水/甲醇溶液，甲醇∶水=(0～1)∶1(体积比)，或者pH值分别为3.49、6.78、7.54、7.97的0.1 mol/L 磷酸二氢钾/磷酸氢二甲缓冲盐水溶液；流速1.0 mL/min；进样体积10～100 μL，柱温25 ℃；RI检测器温度40 ℃。

1.2.2样品分析

称取0.002 0 g PEO/PEG系列标准品溶于2 mL样品瓶中，静置过夜后，轻轻摇匀，经0.45 μm滤膜过滤后进样测试。PVP样品采用同样方法配制后进样测试。采用变色龙7.2.9软件记录色谱图，采用千谱HW2000工作站计算相对分子质量及其分布。

1.2.3普适校正方法[8]

为了尽量减小标样分子形态和样品之间的差异带来的误差，通常采用流体力学体积为基础进行普适校正，根据Einstein黏度关系式1，聚合物的流体力学体积仅与特性黏度和相对分子质量有关。

[η]=2.5NV′/M

(1)

其中，[η]为特性黏度；V′表示聚合物链等效流体力学体积；N为阿伏伽德罗常数；M为聚合物相对分子质量。

根据Benoit提出并证明的普适校正原理，在一个很宽的聚合物结构范围内，所有聚合物的淋洗体积对lg[η]M落在了同一条曲线上，当样品与标样有相同的淋洗体积时，有以下方程：

[η]1M1=[η]2M2

(2)

其中，下标1为标样参数，下标2为样品参数。

将Mark-Houwink方程：

[η]=KMα

(3)

带入(2)式，可以推导出：

(4)

因此，只需要知道标样和样品在流动相中的Mark-Houwink参数K和α，即可计算得到样品的相对分子质量。Mark-Houwink参数K和α是与溶剂、温度有关的常数。在本实验中，以0.1 mol/L LiNO3/甲醇=1∶1(体积比)为流动相(pH值= 6.79)，以PEO/PEG标准品进样绘制标准曲线，如图1所示。

图1 标准校正曲线

其线性拟合公式为：

lgM=13.459 9-0.525 1Ve

(5)

其中：Ve为保留时间，相关系数为0.994 9。查阅文献得到，在该体系下PVP的Mark-Houwink参数KPVP=1×10-4，αPVP=0.7；标准品PEO/PEG的KPEO=2.21×10-4，αPEO=0.75[15]。αPVP和αPEO都大于0.65，这说明该流动相体系对于标样和待测样都是良溶剂，符合普适校正方法的使用条件[7,16]。

2 结果与讨论

2.1 流动相对非体积排除效应的影响

2.1.1离子强度

实验所用色谱柱的固定相为羟甲基丙烯酸酯凝胶，单纯使用水作为流动相时很容易发生PVP和固定相之间的吸附作用，导致峰形杂乱、分裂，没有规律。因此，以水作为流动相，添加不同质量的LiNO3配置不同离子强度的流动相，对比了K90、K85、K60、K30、K17的保留时间和离子强度的关系。结果如图2所示。

离子强度为0时，峰型杂乱且没有重复性，无法确定保留时间，因此未在图2中列出。

在离子强度<0.1 mol/L时，PVP的保留时间随离子强度变化明显，而离子强度>0.1 mol/L时，PVP的保留时间随离子强度变化不大。这说明，在离子强度<0.1 mol/L时，加入的离子能够在一定程度上抑制样品和固定相之间的吸附作用，但是还不能够完全消除吸附作用，当离子强度>0.1 mol/L后，保留时间随离子强度变化不大，说明这时样品在流动相中的形态基本稳定。从图2中还可以看到，相对分子质量相对较低的K17、K30和K60的保留时间随离子强度增加基本不变，而相对分子质量较高的K85、K90保留时间随离子强度增加变化明显，这说明高相对分子质量的PVP更容易被色谱柱固定相吸附。过高的离子强度可能影响固定相的稳定性，所以实验选取离子强度为0.1 mol/L进行研究。实验中还采用LiBr、NaSO4、NaN3以及磷酸缓冲盐溶液进行了类似的研究。结果表明，这几种盐对PVP的峰型和分离效果都有明显的改善作用，其作用效果几乎完全相同，从保护色谱柱和安全角度考虑，选择了LiNO3作为添加剂。

图2 流动相离子强度对样品保留时间的影响

2.1.2pH值

以磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配置离子强度为0.1 mol/L，pH值为3.49、6.78、7.54、7.97的磷酸盐缓冲溶液作为流动相，考察不同pH值时PVP样品的分离情况如图3所示。

图3 pH值对PVP样品保留时间的影响

由图3可以看出，随着pH值的下降，不同相对分子质量PVP样品的分离程度逐渐增大，pH值为3.49时，样品间的分离程度最大。相对分子质量较低的K17和K30的保留时间和峰型随pH值变化不明显，而K60、K85和K90保留时间随流动相pH值变化很大，尤其在流动相pH值由7.79降低至6.78的过程中，保留时间变化非常大，而pH值进一步从6.78降低至3.49时，保留时间变化相对较小。这说明在碱性的流动相环境中，高相对分子质量的PVP更容易被色谱柱吸附，而在中性和酸性条件下吸附现象明显改善，考虑到色谱柱凝胶的耐受性，最终选择在pH值=6.78的中性条件下进行测试。

2.1.3疏水作用

PVP是一种亲水性聚合物，但由于其分子结构中含有的长碳链而具有一定的疏水性，而且相对分子质量越大这种疏水性表现的更加显著。实验中配制了LiNO3浓度0.1 mol/L，甲醇∶水体积比分别为0、3∶7、1∶1的流动相研究疏水作用对PVP在色谱柱中分离效果的影响，见图4。

图4 流动相中甲醇含量对PVP分离效果的影响

由图4可以看到，当流动相中没有甲醇时，不同相对分子质量的组分保留时间非常集中，而甲醇含量增加到30%和50%时，各组分得到比较有效的分离。从峰形上可以看到，在不加甲醇时，K30、K60、K90的峰型严重不对称，出现了严重的拖尾现象。而加入甲醇之后明显改善了PVP的分离效果，使得色谱峰更加对称，呈现更好的GPC行为。而且，PVP相对分子质量越大，甲醇对峰型改善效果越明显。这些现象都说明在增加了疏水性的流动相中，PVP的分子形态更加舒展，不同相对分子质量的组分能够得到更好地分离，这也说明疏水作用对PVP在色谱柱上的分离有明显影响。

2.2 普适校正方法

2.2.1进样量的影响

将K90样品分别按照10、20、50、100 μL的进样量注入色谱系统进行测试，结果见图5和表1。

图5 不同进样量对GPC色谱图的影响

表1 不同进样量下K90的相对分子质量

由图5和表1可以看到，进样量对样品峰型和测试结果影响很小。但是考虑到进样量过小时，信号强度低，峰面积小，在数据处理过程中可能导致更大的误差；而对于高相对分子质量的PVP K85和K90产品来说，进样量过大时可能出现色谱柱“过载”，因此选择50 μL作为进样量。

2.2.2重复性

分别考察了相对分子质量较高的K60、K85、K90和BASF K85相对分子质量测试的重复性，见表2、表3。

表2 K85和BASF K85重复测试相对分子质量数据

表3 K60和K90重复测试相对分子质量数据

由表2和表3可以看到，测试得到的K60、K85、K90的相对分子质量与BASF公司和Asland公司公布的数据是基本符合的[15,17]。多次测试结果的重均相对分子质量RSD均低于5%，满足GPC重复性±5%的要求，数均相对分子质量RSD略高于重均相对分子质量测试结果，但也低于10%，满足GPC重复性要求，说明本方法具有良好的重复性。

3 结论

①LiNO3离子强度0～0.4 mol/L范围内，增加离子强度有利于减少PVP样品和色谱柱之间的吸附，提高样品分离效率；当离子强度较小时，固定相对PVP样品吸附作用较强，峰型很差，没有重复性，表现出非常明显的非体积效应；离子强度达到0.1 mol/L之后，固定相对PVP的吸附得到有效抑制，样品基本能够按体积大小分离。②采用磷酸缓冲盐溶液作为流动相考察了pH值为3.49～7.97范围内发现PVP的GPC行为。当流动相呈碱性即pH值为7.54和7.97时，PVP样品分离效果较差，pH值为中性或弱酸性时即pH值=6.78和3.49时，PVP在色谱柱上分离效果较好，非体积排除效应得到减弱。③通过增大流动相中甲醇的比例能够显著改善样品峰型，增大PVP样品的分离程度。④以PEO/PEG为标样，0.1 mol/L LiNO3∶甲醇=1∶1(体积比)为流动相，结合普适校正方法测试了K60、K85和K90样品的相对分子质量及其分布。使用该方法进行测试时，进样量对测试结果的影响不大；测试K60、K85、K90样品重复性良好，重均相对分子质量相对标准偏差低于5%，数均分子量相对标准偏差低于10%。