郭田燕，李俊玲，王鹤洁，窦敏敏，李 君，秦 健，杜 荣

（1.山西农业大学动物医学学院，山西太谷 030801；2.山西农业大学实验教学中心，山西太谷 030801；3.山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801）

糖皮质激素（Glucocorticoid，GC）对动物机体生命活动有非常重要的作用[1]，主要体现在生理和药理2 个方面。在生理方面，当机体受到外界环境各种应激刺激（饥饿、寒冷、缺氧等）时，GC 分泌增多，使机体加速代谢来抵抗外界刺激[2]；在药理方面，临床上通常会使用糖皮质激素来治疗一些疾病，如抗炎症、抗过敏和调节免疫力等[3-5]。哺乳动物在妊娠期间，来自母体的糖皮质激素可以通过胎盘作用到胎鼠，在胎儿的生长发育过程中发挥重要的作用[6-7]。但如果母体处于应激导致内源性糖皮质激素增加或者长期用药导致子宫内外源性糖皮质激素含量升高，超过一定限度时会对胎儿的生长发育产生不良影响[8]。其中，骨骼肌是糖皮质激素作用的靶点之一，当体内糖皮质激素水平处于病理剂量时，会导致肌肉发育受阻、质量下降[9]。

Pax3、Pax7 均是Pax（paired box）家族的成员，是肌源性祖细胞的重要调控因子，其中，Pax3 主要激活肌细胞生成因子Myf5 和肌细胞决定因子MyoD，在初级生肌过程中扮演重要角色[10-11]；Pax7 则是维持肌卫星细胞的重要因子[12]，在肌肉的发生和再生过程中发挥着不可或缺的作用[13]。研究表明，肌肉发育负调控因子Myostatin 在胚胎期主要是通过抑制成肌细胞的增殖分化来影响骨骼肌发育，Myostatin可以通过下调肌肉发育正调控的相关基因来影响骨骼肌的生长[14-15]。

本试验通过建立小鼠母体应激模型，探讨母体遭遇糖皮质激素过量时对胎儿骨骼肌发育的影响是否对Myostatin、Pax3 和Pax7 的表达产生影响，并通过生物信息学分析其潜在的调控关系，旨在为进一步深入研究家畜母体应激对子代骨骼肌发育影响的分子调控机制奠定基础，也为防治动物母体糖皮质激素过度导致的胎儿肌肉发育迟缓提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 供试动物为10 只8 周龄雌鼠、5 只10 周龄雄鼠，质量25～30 g，均购自山西医科大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂和设备 地塞米松针剂和生理盐水购自同仁大药房，小鼠糖皮质激素酶联分析试剂盒购自江苏酶免实业有限公司，Trizol 试剂、反转录试剂和荧光定量试剂均购自TaKaRa 公司。

生物组织包埋机（益迪医药设备厂）、切片机和烤片机（益迪医药设备厂）、光学显微镜（德国Leica）、荧光定量PCR 仪（美国BIO-RAD）、核酸蛋白测定仪（美国Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 动物饲养及处理 雌雄鼠分笼饲养于SPF级动物房。试验处理当日18：00 雌雄2∶1 合笼过夜，并于次日6：30 检查雌鼠的阴栓，查见阴栓之日定为怀孕第0 天（Embryonic day，E0）。将孕鼠随机分成2 组：对照组（生理盐水，0.2 mL/d）、地塞米松处理组（62.5 μg/mL，0.2 mL/d），每组4 只；怀孕第12 天（E12），开始对2 组孕鼠分别进行连续3 d（E12～E14）的相应处理；怀孕第15 天（E15）分别从每组取出孕鼠，采取胎盘内的羊水及胎鼠骨骼肌，分别保存在-20 ℃冰箱和液氮中用于后续试验。

1.2.2 糖皮质激素（GC）含量的酶联免疫测定 将收集的羊水离心后取上清液；酶联免疫试剂盒在室温下平衡1 h，稀释标准品，孵育30 min 后洗板；加入酶标试剂孵育30 min 后再次洗板；加入显色液，避光显色15 min 后测定OD 值。

1.2.3 胎鼠肌肉组织HE 染色观察 将胎鼠骨骼肌组织放在Bouin's 固定液中固定24 h，流水冲洗过夜；修整组织块并依次放入梯度酒精脱水；组织块经包埋机石蜡包埋，然后进行切片- 展片- 捞片-烤片；将烤干的切片脱蜡并水化，用苏木精和醇溶性伊红进行染色，再次脱水后用中性树胶封片。将切片置于光学显微镜下进行观察。

1.2.4 基因差异表达分析 根据GenBank 收录的小鼠GAPDH、Myostatin、Pax3、Pax7 基因mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 设计特异性引物，引物序列如表1 所示。引物均由北京华大基因生物技术有限公司合成。

表1 引物序列

利用Trizol 法提取胎鼠骨骼肌总RNA，采用反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA，并在核酸蛋白测定仪上检测cDNA 浓度，并稀释至100 ng/μL。以cDNA 为模板进行荧光定量PCR，其中，反应体系为10 μL：SYBR Premix Ex Taq TMII（2×）5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 补足到10 μL。反应条件为95 ℃2 min；95 ℃30 s，58 ℃34 s，40 个循环。

采用2－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，其中GAPDH 为内参基因。利用SPSS 软件中的独立样本t 检验法进行分析，用GraphPad Prism 软件绘图。

1.2.5 调控元件的生物信息学预测分析 用线上软件Genomatix 中的MatInspector Program 对小鼠Myostatin、Pax3、Pax7 基因的5′调控区元件进行预测分析。

2 结果与分析

2.1 孕鼠胎盘羊水中GC 含量变化

采用ELISA 试剂盒检测孕鼠胎盘羊水中GC含量变化结果如图1 所示，地塞米松处理组的GC含量极显著高于对照组（P＜0.01），表明前期处理时注射的地塞米松进入了孕鼠胎盘，可进行后续试验。

2.2 胎鼠肌纤维显微结构的变化

胎鼠骨骼肌HE 染色结果如图2 所示，对照组的骨骼肌纤维紧密整齐，地塞米松处理组的骨骼肌纤维稀疏凌乱。表明对孕鼠注射的地塞米松可被胎鼠吸收，并对胎鼠骨骼肌的发育产生不良影响。

2.3 胎鼠骨骼肌Myostatin、Pax3 和Pax7 的表达变化

荧光定量检测胎鼠骨骼肌Myostatin、Pax3 和Pax7 的表达结果如图3 所示，地塞米松处理组Myostatin 的表达量升高，差异极显著（P＜0.01）；Pax3 的表达量降低，差异显著（P＜0.05）；Pax7 的表达量下降，差异极显著（P＜0.01）。

2.4 小鼠Myostatin、Pax3 和Pax7 基因5′调控区元件预测结果

利用生物信息学软件预测可知，各基因5′调控区存在许多肌肉发育相关的调控元件；经分析发现，Myostatin 基因5′调控区存在GRE、PAX7 等元件；Pax3 基因5′调控区存在GRE、nGRE（negative GRE）、PAX7 等元件；Pax7 基因5′调控区存在GRE、nGRE、PAX3 等元件（图4）。预示着糖皮质激素可能通过糖皮质激素受体（GR）与糖皮质激素受体元件（GRE）结合而直接调控3 种靶基因的转录，也可能存在间接的相互调控关系。

3 结论与讨论

糖皮质激素作为应激反应的重要参与者以及多种疾病的有效药物，其对机体的利害双重效应表现的极其复杂且不易平衡[16]，特别是对动物和人类胚胎期发育的负面影响，一旦发生便难以补救[17]。有研究表明，母体长期在不良环境下应激或糖皮质激素使用不当的情况下，会对胎儿发育带来一定的副作用[18]，这种影响涉及到多个组织器官，其中包括骨骼肌组织。本研究中，ELISA 检测结果显示，地塞米松处理组母鼠羊水中的GC 含量显著升高，表明地塞米松可通过胎盘屏障作用于胎鼠。通过显微结构观察发现，地塞米松处理组胎鼠的骨骼肌肌纤维明显的发育不良，表明母体应激导致胎鼠肌肉发育障碍的模型构建成功。有研究发现，一定浓度的地塞米松可以影响成年鼠Myomaker 和MyoD 的表达[19]，胎儿在子宫内过早暴露于糖皮质激素，会损害肌肉生长。GOKULAKRISHNAN 等[20]给怀孕第13～21 天的大鼠注射地塞米松的研究发现，胎鼠Pax7、MyoD和MyoG 的表达发生了变化，进而抑制了肌祖细胞增殖，影响了骨骼的形成和发育。

动物胚胎期骨骼肌的发育是一个多种因子精细调控的复杂过程，其中，Pax3 是胚胎发育初期促进成肌发生的重要因子[21-22]，而Myostatin 则是成肌细胞增殖和分化的负调控因子[23]。本试验中，荧光定量结果显示，母体注射地塞米松胎鼠Myostatin的表达极显著上调，而Pax3 表达显著下调，说明糖皮质激素对胎儿骨骼肌发育的抑制作用可能与其调控了Pax3 和Myostatin 基因的表达有关。从出生时的肌肉表型看，Pax7 对胚胎期肌肉的形成和发育似乎并不是必需的，因为Pax7 基因敲除纯合体胎鼠肌肉的发育在出生前并没有受到影响[24]。所以，本试验中，Pax7 基因表达的显著下调应该不是导致胎鼠肌纤维发育受阻的主要原因。但事实上，由于Pax7 会影响胚胎期肌卫星细胞的形成和发育[25]，其在胚胎期的正常表达对动物出生后肌肉的发育和再生至关重要。可见，糖皮质激素在胚胎期对Pax7基因表达的影响可能会延伸到出生后肌肉的发育和再生能力。

糖皮质激素对基因的转录激活主要是通过糖皮质激素受体（GR）与糖皮质激素受体元件（GRE）结合来介导的[26]。利用生物信息学软件对Myostatin、Pax3 和Pax7 的5′调控区分析发现，都存在GRE 元件，Pax3 和Pax7 的5′调控区还存在nGRE 元件。因此，糖皮质激素对胎鼠骨骼肌中这3 个基因的转录调控很可能是一种直接效应。当然，这种调控作用也可能是间接的，或者同时存在直接和间接2 种情况，因为通过生物信息学软件分析发现，2 种转录因子Pax3 和Pax7 基因5′调控区各自存在对方的相应元件PAX7 和PAX3，而Myostatin 基因5′调控区也预测到PAX7 元件。这种复杂的相互调控机制还需要通过后续的体内和体外试验进一步证实。

地塞米松处理孕鼠后可以通过胎盘屏障并调控骨骼肌发育相关基因Pax3、Pax7 和Myostatin 的转录表达，进而对胎鼠骨骼肌的发育造成不良影响，而糖皮质激素对相关基因的转录调控作用可能是直接或（和）间接的。本研究结果为后续深入研究家畜母体应激对胎儿骨骼肌发育影响的分子调控机制奠定了基础，也为防治母体应激导致的胎儿骨骼肌发育受阻提供了理论依据。