陈明 向阳

【摘 要】 目的：探究楓杨诱导类风湿关节炎大鼠细胞凋亡的机制，为枫杨治疗类风湿关节炎提供科学依据。方法：雄性健康SD大鼠60只，随机分为空白组、模型组、雷公藤多苷组、枫杨水煎液低、中、高剂量组，除空白组外，其余各组建立CIA模型。造模成功后，分别给予相应治疗，测量膝关节直径，进行关节炎评分，观察滑膜切片，检测血清炎症因子水平和相关凋亡蛋白的表达。结果：①一般情况：与模型组比较，各用药组体重明显增加，膝关节直径、关节炎指数均有所下降，其中枫杨高剂量组效果优于雷公藤多苷组（P<0.05）。②滑膜组织病理形态观察：HE染色结果显示，模型组大鼠膝关节有大量炎性细胞浸润。枫杨治疗组能够显著缓解膝关节肿胀程度，抑制足部的红肿，HE染色镜下表现及评分也有所改善（P<0.05）。③ 细胞因子和相关蛋白：与模型组相比，各治疗组TGF-β、IL-4水平明显升高，IL-17A、IFN-γ水平显著降低（P<0.05）;滑膜组织中，Bcl-xl蛋白的表达降低，Caspase-8表达增加（P<0.05）。对于TNFRII，则存在枫杨低剂量组降低，中、高剂量组明显上调其表达（P<0.05）。结论：枫杨水煎液可有效缓解CIA大鼠临床症状及病理改变，降低血清炎性细胞因子、提升抗炎因子水平，上调滑膜促凋亡蛋白、下调凋亡抑制蛋白表达，促进CIA大鼠滑膜细胞凋亡。

【关键词】 枫杨;胶原诱导关节炎;滑膜细胞;凋亡

【中图分类号】R593.22   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2021）17-0023-07

Mechanism of Hubei Fengyang Decoction Induced-Apoptosis of

Synovial Cells in CIA Rats

CHEN Ming1，2XIANG Yang1，2*

1.Department of Medicine，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China;

2.HubeiProvinceKey Laboratory of occurrence and intervention of RheumaticDiseases（Hubei University for Nationalities），Enshi 445000，China

Abstract：ObjectiveTo observe the therapeutic efficacy of Fengyang on rheumatoid  arthritis and evaluate the effect of Fengyang to induce synovial fibroblast cell  apoptosis in collagen-induced arthritic （CIA） rats.Methods Sixty healthy male SD rats divided into CIA control control （CC） group，Triptery giumpoly glycoside（TG）-treating group，and three Fengyang-treating（FY） groups bred with low，medium and high dose of Fengyang decoction.After successful establishment of the model，the diameter of knee joint was measured，the score of arthritis was scored，the synovium section was observed，and the level of serum inflammatory factors and the expression of apoptosis-related proteins were detected. Results ①General conditions：Compared with the model group，the weight of rats in each medication group increased significantly，the diameter of knee joint and the arthritis index decreased，among which，the effect of the high dose group of FY was better than that of the TG group （P<0.05）.②Pathological observation of synovial tissue：The results of HE staining showed that there was a large amount of inflammatory cell infiltration in the knee joints of rats in the model group. FY groups could significantly alleviate the swelling degre of knee joint，inhibit the swelling of foot，and decrease the score of HE staining microscopy （P<0.05）.③ELISA results for cytokines and Western Blot test for apoptosis-associated protein：Compared with the model group，the levels of TGF-β and IL-4 were significantly increased and the levels of IL-17A and IFN-γ were significantly decreased in each treatment group （P<0.05）.④Western Blot test for apoptosis-associated proteins： Compared with the CC group，the expression of TNFRII in medium-dose and high-dose FY groups was significantly increased（P<0.05）;The expression of Caspase-8 protein in each drug group was significantly increased（P<0.05）;The expression of Bcl-xl protein was decreased in all medication groups（P<0.05）.Conclusion The efficacy of Fengyang in treatment of collagen-induced arthritic rats may partially obtained by inducing synovial fibroblast cell apoptosisand regulating the expression of cytokines IL-17A， TGF-β，IFN-γ，IL-4.

Keywords：Pterocarya;Collageninducearthritis;Synovialcells;Apoptosis

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以关节滑膜慢性炎症及关节的进行性破坏为主要特征，以对称性多关节炎为主要临床表现，常见关节处疼痛、肿胀，呈持续性、反复性发作[1-4]。若不及时治疗，最终可引起关节畸形，丧失关节功能。RA的发病机制并不十分明确，滑膜细胞增殖与凋亡失衡是目前研究的重要方向。RA滑膜细胞的增殖与炎性细胞浸润、血管翳形成、侵蚀软骨及骨组织损伤为主要病理特征，从而导致关节结构破坏、畸形及功能丧失[5]。有研究[6]发现，RA患者滑膜细胞增生明显，而细胞凋亡率显著减少，却并没有因过度增生出现过多的细胞凋亡，提示滑膜细胞的凋亡障碍可能是导致滑膜增厚的原因之一。有研究[7-8]表明，湖北枫杨（Pterocarya Hupehensis Skan，PHS）通过影响线粒体凋亡途径诱导RA滑膜细胞凋亡，本实验建立CIA模型大鼠，用湖北枫杨水煎液进行干预，进一步探讨枫杨对CIA大鼠膝关节滑膜凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠60只（200±20）g，购于武汉剑悦生物科技有限公司，许可证号为SCXK（辽）2015-0001。

1.2 药材与试剂 湖北枫杨树皮，采自湖北省恩施市清江河滩，经袁林副教授鉴定，为胡桃科Juglandaceae枫杨属Pterocary Kunth植物。甲醇、异丙醇、冰醋酸（武汉市中天化工有限责任公司）;BCA试剂盒、HRP标记的羊抗兔二抗（武汉科瑞生物技术有限公司）;雷公藤多苷片（浙江得恩德制药股份有限公司）;牛Ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂（美国Sigma公司）;大鼠IL-4、IFN-γ、TGF-β、IL-17AELISA试剂盒（酶联生物）;β-Actin 抗体、HRP 羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司）;Bcl-xl、Caspase-8（abcam公司）;TNFRⅡ抗体（美国CST公司）;RIPA裂解液、彩色预染蛋白质分子量标准（10-180kD）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、蛋白酶抑制剂（上海碧云天生物技术研究所）。

1.3 设备和仪器 酶标仪（Thermo公司）;电泳仪电源（北京六一生物科技有限公司）;包埋机（美国通用电气医疗集团）;石蜡切片机（Leica公司）;化学发光成像分析仪（美国通用电气医疗集团）。

2 实验方法

2.1 模型建立 60只大鼠适应性喂养1周，随机选取10只作为正常组，其余50只制作CIA模型。

2.2 动物分组 将造模成功的50只大鼠，随机分为5组，分别为模型组、雷公藤多苷组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只，未造模的10只大鼠作为正常组。

2.3 给药方案 雷公藤多苷组大鼠予以6.25mg/（kg·d）的雷公藤多苷混悬液灌服，枫杨低、中、高剂量组分别给予2.0g/（kg·d）、4.0g/（kg·d）、8.0g/（kg·d） 的水煎液灌服，正常组、模型组灌服等体积的生理盐水，每组大鼠每天灌胃1次，连续灌胃28 d。

2.4 取材 灌胃28 d后，禁食禁水12 h，待麻醉成功，打开胸腔，用采血针于心尖搏动处取血，用于ELISA法检测血清TGF-β、IFN-γ、IL-17A及IL-4水平。充分暴露大鼠双膝关节腔，髌骨处可见一层淡黄色光滑组织，即为滑膜组织，利用手术刀及手术镊小心对其进行剥离并分离。

2.5 一般情况 每7天测量一次体重、膝关节直径、并进行关节炎评分，用以评价关节炎症程度。关节炎评分按照以下标准：0分：无红肿;1分：小趾关节红肿;2分：趾关节和足趾肿胀;3分：踝关节以下的足爪肿胀;4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。

2.6 HE染色 将组织从多聚甲醛固定液中取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，经酒精脱水、二甲苯透明，明胶浸蜡及石蜡树脂等包埋成含有滑膜组织的石蜡块。蜡凝固后，从包埋框中取出，并进行修整。将修整好的蜡块置于切片机上切片，切片漂浮于摊片机温水上将组织摊平，用载玻片将组织捞起，放入烘箱中烤片。取出切片，置于自动染色机脱蜡染色，再用中性树胶封片。最后镜下观察，并进行病理学评分。关节组织病理学评分标准为：组织无病理学改变，记作0分;轻微炎症浸润记为1分;中度记为2分;重度，但无血管翳生成记3分;严重的炎症浸润，形成血管翳或软骨、骨侵蚀，记4分。

2.7 ELISA法 检测血清细胞因子水平  按照ELISA试剂盒方法检测血清TGF-β、IFN-γ、IL-17A及IL-4水平。

2.8 Western Blot法检测相关蛋白表达 提取滑膜蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，然后将各组蛋白煮沸，加入四分之一体积的蛋白上样缓冲液（5×）。取适量的样本，在凝胶中依次加入蛋白上样缓冲液（1×），Maker，各组蛋白样本，蛋白上样缓冲液（1×）进行电泳。再将蛋白轉移至PVDF膜上，用3%浓度的BSA封闭1h，加入不同的一抗进行孵育：TNFRⅡ（1∶1000），Caspase-8（1∶1200），Bcl-xl（1∶1000）。过夜之后取出，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，放入二抗（1∶12000），孵育2 h，TBST溶液洗膜3次。最后进行显色，ImageJ软件分析条带的灰度值，以内参β-acting作为对照，得到各目的蛋白的相对表达量。实验独立重复3次。

2.9 统计学处理 所有数据用SPSS 24.0软件进行处理，均以均数加减标准差（x±s）的形式表示，样本均数用t检验进行比较，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05则差异有显著性意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况 正常组大鼠精神状态较好，体重明显增加，皮毛顺亮，饮食正常，足部皮肤无红肿情况，活动自如。模型组大鼠体重增长较正常组缓慢，皮毛较为暗淡枯槁，活动量明显减少，足部皮肤发红肿起，关节活动受限。各治疗组大鼠关节肿胀程度均有所降低，饮食量略有增加，体重逐渐增长，足部皮肤情况也有所改善。

3.2 体重变化 与正常组比较，模型组大鼠体重增长缓慢。用药后，各治疗组大鼠体重均有所增加，枫杨中、高剂量组和雷公藤多苷组体重增长明显（P<0.05），枫杨低剂量组在用药2周后体重明显增加（P<0.05）。如图1所示。

3.3 枫杨水煎液对CIA模型大鼠膝关节直径的影响 模型组与正常组相比，关节直径明显增大（P<0.05），治疗1周后，各用药组与模型组比较，关节直径有所减小（P<0.05），到第4周发现，关节直径明显减小（P<0.05）。与雷公藤多苷组相比，枫杨高剂量组对大鼠关节肿胀的改善更为显著（P<0.05）。如图2所示。

3.4 枫杨水煎液对CIA模型大鼠关节炎指数的影响 模型组与正常组比较，有显著性差异（P<0.01），且模型组数据上升，提示造模成功。治疗1周后，雷公藤多苷组和枫杨高剂量组与模型组比较，有显著性差异（P<0.05），治疗2周以后，各治疗组与模型组相比，有显著性差异（P<0.05）。且与雷公藤多苷组相比，枫杨高剂量组对关节炎指数的改善有显著效果（P<0.05）。如图3所示。

3.5 枫杨水煎液对CIA模型大鼠关节滑膜的影响 与正常组比较，模型组大鼠滑膜病理评分明显升高（P<0.05），与模型组比较，各用药组病理评分明显降低（P<0.05），与雷公藤多苷组相比，枫杨高剂量组改善病理方面更为显著（P<0.05），如图4所示。镜下可见：正常组大鼠滑膜组织中无明显病理变化，模型组出现大量炎性细胞浸润，滑膜细胞增多，且呈现多层，达到5～6层甚至更多。各用药组与模型组相比，滑膜增生，炎性细胞浸润有所缓解，层数也有所减少，而枫杨高剂量组效果最为明显，如图5所示。

3.6 枫杨水煎液对CIA大鼠血清炎性因子水平的影响 与正常组相比，模型组大鼠血清中 TGF-β、IL-4含量明显降低（P<0.05），IFN-γ、IL-17A含量明显升高（P<0.05）;与模型组相比，各用药组大鼠TGF-β、IL-4水平明显提高（P<0.05），IFN-γ、IL-17A显著降低（P<0.05）;与雷公藤多苷组相比，低剂量组对TGF-β含量的升高和IFN-γ的降低更为明显（P<0.05），高剂量组对IL-17A水平的降低和IL-4的升高更为明显（P<0.05）。如图6所示。

3.7 枫杨水煎液对CIA模型大鼠凋亡相关蛋白表达的影响 与正常组相比，CIA大鼠TNFRⅡ、Bcl-xl的蛋白表达显著增加（P<0.05），Caspase-8的表达显著降低（P<0.05）。与模型组比较：雷公藤多苷组和枫杨低剂量组大鼠的TNFRⅡ表达明显降低（P<0.05）;枫杨中、高剂量组TNFRⅡ表达反而明显升高（P<0.05）;楓杨低、中、高剂量组Caspase-8蛋白表达显著增加（P<0.05），且均显著高于雷公藤多苷组（P<0.05）;各用药组Bcl-xl蛋白表达均降低，其中枫杨低剂量组差异有显著性意义（P<0.05）;枫杨低剂量组Bcl-xl表达水平显著低于雷公藤多苷组（P<0.05）。如图7所示。

4 讨论

细胞凋亡有两个途径：内源性途径和外源性途径[9]。线粒体是发生内源性途径的重要细胞器，而细胞表面死亡受体是介导含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-8（Cysteinyl aspartate specific proteinase-8，caspase-8）激活的外源性途径[10]。外源性途径中，死亡受体激活的起始Caspase是Caspase-8，Caspase-8可通过激活Caspase-3执行凋亡。另外，还能够切割细胞基质中的B细胞淋巴瘤（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白家族成员Bid前体[11]，形成截断的Bid（tBid），tBid可进入线粒体中，并促使Bax等蛋白产生寡聚反应，诱导细胞色素C（Cytochrome C，Cyt-C），同时使凋亡诱导因子AIF及其他相关凋亡信号从线粒体释放，进而诱导细胞凋亡[12]。研究发现枫杨水煎液可使大鼠滑膜组织凋亡诱导蛋白Caspase-8表达增加，凋亡抑制蛋白Bcl-xl表达降低。结合前期研究结果，说明枫杨能够通过上调Capase-8并作用于Caspase-3和B细胞淋巴瘤-xl（B-cell lymphoma-xl，Bcl-xl）蛋白，引起Cyt-C和其他凋亡信号的释放增加，从而促进滑膜细胞凋亡。

肿瘤坏死因子受体（Tumor necrosis factor receptor，TNFR）在免疫系统及相关疾病中发挥重要作用，包括Ι型（TNFRΙ）和Ⅱ型（TNFRⅡ）。肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）可分别与TNFRΙ和TNFRⅡ结合，介导不同的生物学活性[13]。在正常生理情况下，TNF-TNFRs系统保持凋亡与增殖两方面功能的平衡，病理条件下，介导两条相反的信号通路，会破坏这种平衡，导致机体免疫环境与功能紊乱，引起滑膜组织增生与炎症，发生疾病。体外分别培养RA患者与正常人的成纤维滑膜细胞[14]，发现与健康人相比，RA患者的滑膜细胞增生是通过上调TNFRΙ，下调TNFRⅡ表达，来激活TNFR相关因子，导致核转录因子-κB（Nuclear factor-kappaB，NF-κB）进一步活化，阻碍细胞的正常凋亡，造成滑膜细胞过度增殖，组织增生。Blüml研究[15]发现，TNFRΙ是关节炎发生的主要原因，而同时存在的TNFRⅡ对关节炎有保护作用。TNFRⅡ胞内不存在死亡结构域[16]，但是能够募集肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receeptor associated factor 2，TRAF2），激活丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB信号通路，发挥抗炎作用。

实验结果显示，枫杨干预CIA大鼠后，低剂量组下调TNFRII，与雷公藤多苷作用相似;而中、高剂量则对TNFRⅡ有上调作用，与雷公藤多苷完全相反。枫杨对TNFRII明显的双向调节现象的机制与意义尚不清楚，但值得进一步研究。考虑到TNFRII对关节炎症的保护作用，推测中、高剂量枫杨通过上调TNFRⅡ表达，与TNFRΙ竞争TRAF2，从而促进滑膜细胞凋亡，同时抑制NF-κB信号通路上的炎症因子的释放，参与抗炎通路中的炎症反应过程。这一发现对选择枫杨治疗剂量具有重要参考价值。前期细胞实验结果显示，湖北枫杨可通过调控相关蛋白的表达，影响线粒体凋亡途径，从而诱导MH7A细胞凋亡。本研究对前期实验进行了延伸，在动物水平进行研究，证实在湖北枫杨对CIA大鼠滑膜细胞的凋亡具有促进作用，其机理可能是通过调节凋亡相关蛋白TNFRⅡ、Bcl-xl和Caspase-8的表达实现的。

参考文献

[1]DAVID L S，FREDERICK W，TOM W J. Rheumatoid arthritis[J]. Lancet，2010，376（9746）：1094-1108.

[2]LINOS A，WORTHINGTON J W，O"Fallon M，et al. Theepidemiologyofrheumatoid arthritisinrochesterminnesota： astudyofincidence，prevalence，andmortality1[J]. American Journal of Epidemiology，1980，111（1）：87-98.

[3]COSTENBADER，KAREN H. Geographic Variation in Rheumatoid Arthritis Incidence Among Women in the United States[J]. Archives of Internal Medicine，168（15）：1664.

[4]叶伟胜，张铁良.类风湿关节炎流行病学进展[J].国际骨科学杂志，2009，30（3）：144-147.

[5]陈琨，董秋梅. 类风湿关节炎滑膜细胞增殖、凋亡实验研究进展[J].内蒙古中医药，2015，13（4）：134-135.

[6]谷远洋，金翔. 白藜芦醇对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响[J].江苏医药，2015，41（18）：2182-2184.

[7]朱健，武璐璐，张全书，等. 枫杨乙醇提物对胶原诱导性关节炎大鼠的治疗作用及其机制研究[J]. 中国药理学通报，2019，35（1）：129-135.

[8]武璐璐，王翔鹏，张全书，等. 枫杨提取物对MH7A细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究[J]. 中国免疫学杂志，2019，35（6）：653-658.

[9]郑凯，杨梅桂，闫朝君，等.线粒体动力学与细胞凋亡[J].中國细胞生物学报，2019，41（8）：1467-1476.

[10]刘芳，毛晓华. 线粒体介导的细胞凋亡研究进展[J]. 现代医学，2002，30（2）：201-203.

[11]CCOURTNEY P A，CROCKARD A D，WILLIAMSON K，et al.Lymphocyte apoptosis in systemic lupus erythematosus： relationships with Fas expression，serum soluble Fas and disease activity.[J]. Lupus，1999，8（7）：508-511.

[12]杨涛，费振海，钟兴明.Caspase家族与细胞凋亡的研究进展[J]. 浙江医学，2018，40（18）：96-100，104.

[13]SCHIRMER M，VALLEJO A N，WEYAND C M，et al. Resistance to apoptosis and elevated expression of Bcl-2 in clonally expanded CD4+CD28 T cells from rheumatoid arthritis patients[J]. Journal of Immunology，1998，161（2）：1018-1025.

[14]YANG J，LIU X，BHAIIA K，et al.Prevention of apoptosis by Bcl-2 release of cytochrome C from mitochondria blocked[J].Science，1997，25（3）：1129-1132.

[15]GATTO B. Biologics targeted at TNF： design，production and challenges[J]. Reumatismo，2011，58（2）：94-103.

[16]REDLICH K. Targeting TNF receptors in rheumatoid arthritis[J]. International Immunology，2012，24（5）：275-281.

（收稿日期：2021-01-13 编辑：刘 斌）

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.81260458;No.81360672）。

作者简介：陈明（1993-），男，汉族，硕士研究生，研究方向为中医内科学。E-mail：274115617@qq.com

通信作者：向阳（1961-），男，土家族，博士，教授、硕士生导师，研究方向为风湿免疫性疾病。E-mail：xiangy1961@126.com