李育林，蔡秋莹，汤晓月，周林桦，任冬霞，吕凡，李云*

（1.四川大学华西公共卫生学院，华西第四医院，四川 成都 610041；2.四川大学华西医院，四川 成都 610041）

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）为木犀科（Oleaceae）木犀属植物，又名九里香、山桂、金栗等。在传统饮食文化中，桂花被添加到酒[1-2]、茶[3]以及糕点中用以增加食品风味。桂花作为我国特有的珍贵纯天然香料，从中提取的桂花露[4]、桂花浸膏及精油[5-6]被应用到化妆品和香水的生产。

黄酮类化合物作为一种次级代谢产物[7]，存在于大多数的水果、蔬菜、茶以及众多植物的根茎叶及花中。众多研究表明，黄酮类化合物具有抑制自由基的氧化反应、降低肿瘤及心脑血管疾病发生风险等多种生理功能[8-10]。刘哲慧等[11]对水芹总黄酮的研究表明，对于由鸡红细胞引起的小鼠血清中的溶血素水平下降，水芹总黄酮具有一定的提高作用。诸多研究证明，桂花提取物具有抗氧化、抑菌、降血糖、镇痛抗炎等生理功能[12-15]。李姗忆等[16]从日香桂根茎中分离得到一个新的化学成分（GH-0521），二甲苯耳廓肿胀实验和醋酸扭体实验的结果表明该化学成分具有一定的抗炎镇痛作用。黄酮类化合物是一种天然的免疫调节剂，可以促进脾淋巴细胞的增殖和增强迟发型变态反应从而增强细胞免疫功能[17]，提高抗体效价[18]，使免疫器官指数增加，增强非特异性免疫[19]，改善机体免疫系统。曹柏营等[20]研究发现藤本豆豆荚总黄酮表现出呈剂量依赖性的增强巨噬细胞系统活性的能力，对小鼠的非特异性免疫具有免疫增强作用。本课题组前期对桂花提取物中黄酮类化合物的体内外抗氧化活性进行了研究[21]，未涉及黄酮类化合物的定性研究。本文对桂花提取物中黄酮类化合物进行成分鉴定，为桂花资源的进一步开发利用提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）：品种为日香桂，采摘于成都市温江区万亩桂花产业园；桂花提取物osthin：由四川大学华西药学院黄静教授课题组提供，常温（25℃）下呈半固体，保存于-20℃冰箱。

无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；芦丁（纯度≥98%）：北京索莱宝科技有限公司；硝酸铝（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；甲醇、乙酸、乙腈（色谱纯）：德国CNW公司。

1.2 仪器与设备

XA-1型高速万能粉碎机：江苏姜堰市银河实验仪器厂；HSY-SP电热恒温水浴箱：北京市永光明医疗器械厂；GZD-D400-BS-II电热恒温干燥箱：上海跃进医疗器械厂；BSA223S电子天平：德国Sartorius公司；EV311旋转蒸发仪：北京莱伯泰科仪器有限公司；Multiskan GO自动酶标读数仪：美国Thermo Fisher科技有限公司；索氏提取器：四川蜀玻有限公司；TGL-16MS台式高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；TYXH-I漩涡振荡器：上海汗诺仪器有限公司；Xevo G2-XS QTof高分辨质谱仪、ACQUITY UPLC高效液相色谱仪、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）：Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 桂花提取物的提取

新鲜桂花采摘后立即在80℃下烘干，粉碎，过40目筛，常温（25℃）避光保存。采用乙醇回流法提取，提取条件：按料液比1∶40（g/mL）加入浓度为80%的乙醇，回流提取时间为3 h，提取温度为70℃。所得提取液在旋转蒸发仪中于65℃下旋转蒸发乙醇后浓缩，使用0.45 μm的微孔滤膜过滤，得桂花提取物。

1.3.2 桂花提取物中黄酮类化合物含量的测定

准确称取芦丁标准品20 mg，30%乙醇溶解，配制成浓度为0.1 mg/mL的标准溶液，备用。分别取上述芦丁标准溶液 0、1、2、3、4、5 mL 加入到 10 mL 的容量瓶，各加入0.4 mL的5%NaNO2溶液，摇匀，静置6 min后加入10%Al（NO3）3溶液0.4 mL，混匀，静置6 min；最后加入4%NaOH溶液4 mL，混匀，用30%乙醇定容，摇匀，10 min后在波长510 nm处测定吸光度。横坐标（X）为芦丁标准溶液的浓度，纵坐标（Y）为吸光度A，绘制标准曲线，并得到回归方程。

取桂花提取物原液、10倍稀释液、20倍稀释液和50倍稀释液各1 mL置于10 mL容量瓶中，按照上述绘制标准曲线的方法，测定其吸光度，选择吸光度在上述标准曲线吸光度A范围内的样品，按照回归方程计算出桂花提取物中黄酮类化合物的含量。

1.3.3 桂花提取物中黄酮类化合物的成分鉴定

1.3.3.1 预处理过程

将桂花提取物离心 10 min（13 000 r/min，4 ℃），用注射器吸取200 μL上清液，使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到进样小瓶，-80℃下保存。

称取15 mg桂花提取物osthin，加入1 mL的甲醇：水（7∶3，体积比），加入两个小钢珠，在-20℃放置 2 min预冷，放入研磨机（60Hz，2min），超声辅助提取 30 min，-20℃静置20 min后，离心10 min（13 000 r/min，4℃），用注射器吸取200 μL的上清液，使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到液相色谱（liquid chromatography，LC）进样小瓶，-80℃下保存。

1.3.3.2 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为含0.1%甲酸的乙腈。洗脱梯度见表1。流速0.4 mL/min，柱温45℃，进样体积 2 μL。

表1 洗脱梯度Table 1 Elution gradient

1.3.3.3 质谱条件

离子源是电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式。质谱参数为毛细管电压+3、-2 kV，样品锥孔电压40 V，源偏移电压80 V，源温度120℃，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气体流速800 L/h，锥孔气流速50 L/h，质量扫描范围m/z50～100。

1.3.3.4 数据处理及结果判定

原始数据的采集使用UNIFI1.8.1软件。在进行模式识别之前，原始数据经Progenesis QI v2.3软件（Nonlinear Dynamics Newcastle UK）进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化，其主要参数为母离子质量偏差5ppm；子离子质量偏差10ppm；子离子强度偏差阈值5%。将正负离子数据合并成一个数据矩阵表。化合物的鉴定基于精确质量数、二级碎片以及同位素分布，使用 The Human Metabolome Database（HMDB）、Lipidmaps（v2.3）和METLIN数据库进行定性。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

根据芦丁的浓度和吸光度绘制的标准曲线见图1，得到浓度和吸光度的回归方程为Y=0.347X+0.045 8，（R2=0.999）。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 桂花提取物中黄酮类化合物的浓度

桂花提取物10倍稀释液的吸光度为0.17，通过回归方程得出桂花提取物中黄酮类化合物的浓度为3.58 mg/mL。

2.3 桂花提取物中黄酮类化合物的成分鉴定

基峰图（base peak chromatogram，BPC）是将每个时间点质谱图中最强离子的强度连续描绘得到的图谱。桂花提取物正负离子模式的BPC见图2和图3，桂花提取物中黄酮类化合物数据信息详见表2。

表2 桂花提取物中黄酮类化合物数据信息Table 2 Data information table of flavonoids in Osmanthus fragrans Lour.extract

图2 桂花提取物正离子模式的BPC图Fig.2 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract in positive ion mode

图3 桂花提取物负离子模式的BPC图Fig.3 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract negative ion mode

由图2、图3和表2可知，通过与HMDB、Lipidmaps（v2.3）和METLIN数据库的对比，将所测物质的理论质荷比（m/z）与实际测得的该物质的质荷比进行比较，得分＞40分，一般为此类化合物。可能的黄酮类化合物有358种，表2列出了得分在前10的黄酮类化合物数据信息，桂花提取物中miconioside B、egonol gentiobiosidev、camellianin A得分较高。

桂花提取物osthin正负离子模式的BPC见图4和图5。桂花提取物osthin中黄酮类化合物数据信息详见表3。

图4 桂花提取物osthin正离子模式的BPC图Fig.4 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract osthin positive ion mode

图5 桂花提取物osthin负离子模式的BPC图Fig.5 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract osthin negative ion mode

表3 桂花提取物osthin中黄酮类化合物数据信息Table 3 Data information sheet of flavonoids in osmanthus extract osthin

由图4、图5和表3可知，通过与HMDB、Lipidmaps（v2.3）和METLIN数据库的对比，将所测物质的理论质荷比（m/z）与实际测得的该物质的质荷比进行比较，得分＞40分，一般为此类化合物。桂花提取物osthin中可能的黄酮类化合物有232种，表3列出了得分在前10的黄酮类化合物数据信息，桂花提取物osthin 中 miconioside B、negletein 6-[rhamnosyl-（1->2）-fucoside]、kenusanone J黄酮类化合物得分较高。

3 结论

分光光度法测得桂花提取物中黄酮类化合物的浓度为3.58 mg/mL。LC-MS的检验结果表明桂花提取物中有 miconioside B、egonol gentiobioside、camellianin A等黄酮类化合物的存在，桂花提取物osthin中有miconioside B、negletein 6-[rhamnosyl-（1->2）-fucoside]、kenusanone J等黄酮类化合物的存在。本研究通过对桂花提取物中黄酮类化合物进行成分鉴定，为其以后在桂花资源的开发利用、桂花提取物中黄酮类化合物的分离纯化、结构鉴定和含量测定等方面的研究提供理论依据。