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富含γ-氨基丁酸的红小米黄酒酿造工艺参数优化

2021-09-16李杰许彬罗建成李慧星于海彦张紫璇戴洪畅

食品研究与开发 2021年17期
关键词:黄酒酿造用量

李杰,许彬,罗建成,李慧星,于海彦,张紫璇,戴洪畅

(1.南阳理工学院张仲景国医国药学院,河南 南阳 473004;2.南阳理工学院生物与化学工程学院,河南 南阳 473004)

红小米,为南阳盆地特产,因谷壳呈红色,本地俗称红谷,学名为“粟”,也称作粱、粟米,是禾本科一年生草本植物“粟”加工去皮后的成品。红小米与糯米、黍米等农作物相比,淀粉含量较低,蛋白质、脂肪和维生素含量较高,且富含人体必需的8种氨基酸,比例协调,具有较高的营养价值。

黄酒是世界上最古老的酒类之一,在我国已有3 000余年的历史,与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒[1-2]。传统黄酒是以糯米、粟米等为原料,采用酒曲糖化、发酵而成,色泽浅黄或红褐,质地醇厚,品味香甜甘冽,浓郁芳香,集甜、酸、苦、辛、鲜、涩六味一体。黄酒富含8种必需氨基酸、活性多肽、功能性低聚糖、有机酸、多种维生素及微量元素等易被人体吸收的营养成分[3-8],被誉为“液体蛋糕”。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种非蛋白质氨基酸,在人体内具有调节心率、降低血压、预防动脉硬化、调节内分泌、预防糖尿病、健肝利肾、防止皮肤老化等特殊生理功能[9-11]。GABA作为一种具有特殊生理活性的功能性因子越来越引起人们的关注,研究表明,黄酒酿造时所用麦曲、红曲、酒药中的霉菌、酵母、细菌等微生物,在代谢过程中可利用谷氨酸(Glu)作为前体物质合成GABA[12]。红小米为南阳盆地特色农作物,与GABA合成代谢所需的前体物质谷氨酸含量达2.92%[13-14]。本研究以红小米为主要原料,对富含GABA的红小米黄酒酿造工艺参数进行优化,可为企业生产实践提供有价值的理论参考。富含GABA的红小米黄酒的产业化生产,将极大提高南阳黄酒的知名度,提升南阳“世界美酒特色产区”的品牌影响力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红小米:南阳市镇平县;绍酒风味T3酿酒曲(根霉菌、α-淀粉酶(20000U/g)、葡萄糖淀粉酶(100000U/g)、酿酒酵母):安琪酵母股份有限公司;麦曲:山东梁山徐曙生物工程有限公司。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)对照品:中国食品药品检定研究院;重蒸苯酚:北京索莱宝科技有限公司;四硼酸钠、氢氧化钾:国药集团化学试剂有限公司;次氯酸钠、三氯化铝、硼酸、无水乙醇:天津科密欧化学试剂有限公司;以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BS110S电子天平:北京赛多利斯天平有限公司;HHS-6电热恒温水浴锅:上海跃进医疗器械厂;XK05-IMS20制冰机:北京中西远大科技有限公司;752N紫外-可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;XH-A旋涡混合器:无锡杰瑞安仪器设备有限公司;DNP-9082电热恒温培养箱:上海精宏试验设备有限公司;TGL-16GR高速台式冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 红小米黄酒酿造工艺流程

采用摊饭法酿造红小米黄酒,具体工艺流程如下。

浸米→蒸煮→摊凉→拌曲(酿酒曲、麦曲)→装罐→前发酵及开耙→后发酵→过滤→煎酒(灭菌)→装坛→陈酿

1.3.2 GABA标准曲线的绘制

精密称取GABA 20.0 mg,蒸馏水溶解,定容至100 mL,摇匀,得浓度为0.2 mg/mL的GABA标准溶液。分别吸取稀释至 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mg/mL的GABA标准溶液1.0 mL,于10 mL具塞试管中,分别加入0.2mL浓度为0.2mol/L的H3BO3缓冲液(pH 9.0)、6%的重蒸苯酚1.0 mL、7%的次氯酸钠溶液0.4 mL,置于漩涡振荡器混匀,沸水浴条件下反应10 min,迅速在冰浴条件下冷却15 min,出现蓝绿色后加入60%的乙醇2.0 mL;另吸取1.0 mL蒸馏水代替GABA标准溶液置于10 mL具塞试管,经上述反应及显色等处理后作为空白对照;分别于630 nm波长处测OD值,以测得的OD值为纵坐标,GABA浓度为横坐标,绘制标准曲线[15-16]。

1.3.3 单因素试验

分别称取经预处理的红小米100 g,置于洁净的500 mL烧杯内,加自来水浸泡,水面超过米层3 cm左右,烧杯口部用2层无菌纱布覆盖,室温20℃下浸泡,早晚各换水1次。24 h后沥干水分,置不锈钢锅内蒸2 h,摊凉冷却至35℃;分别选择麦曲用量(5.5%、7.0%、8.5%、10.0%、11.5%、13.0%)、酿酒曲用量(0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%)、前发酵温度(19、22、25、28、31、34 ℃)、前发酵时间(3、5、7、9、11、13 d)、后发酵温度(9、12、15、18、21 ℃)、后发酵时间(25、35、45、55、65、75 d)6 个因素作为考察因素,选择料液比为1∶1.3(g/mL)进行发酵,酿造红小米黄酒。单因素试验时,每次试验固定其余因素,考察单一因素对GABA含量的影响。

1.3.4 均匀设计试验

在单因素试验基础上,选择麦曲用量(X1)、酿酒曲用量(X2)、前发酵温度(X3)、前发酵时间(X4)、后发酵温度(X5)、后发酵时间(X6)6 个因素,进行均匀设计试验[17-19],选择料液比为 1∶1.3(g/mL)进行发酵,考察不同酿造工艺对红小米黄酒中GABA含量的影响。试验的因素水平如表1所示。

表1 均匀设计试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of uniform design experiment

1.3.5 建立具有预测功能的多层前馈(backpropagation,BP)神经网络

以均匀设计试验结果数据作为BP神经网络的训练样本,考虑到均匀设计试验中因素数为6,输入层神经元个数选择6;试验指标数(GABA含量)为1,输出层神经元个数选择1;中间层神经元个数根据经验选择6;故BP神经网络的拓扑结构为6-6-1,选择BP神经网络训练收敛精度为10-3,利用MATLAB软件,建立BP神经网络[20-21],并随机选择3组实测值与BP神经网络的预测值进行对比。

1.3.6 确定BP神经网络的最优预测值

以BP神经网络的预测输出值作为遗传算法求解的目标值,以均匀设计试验结果作为遗传算法的初始种群,种群规模为12,根据经验,选择交叉概率0.05,变异概率0.01,采用遗传算法寻优确定BP神经网络的最优预测值[22-23]。

1.3.7 红小米黄酒中GABA含量测定

准确量取30.0 mL红小米黄酒样液,作为待测酒样,向其中加入2.0 mol/L的A1C13溶液150 μL,充分混匀振荡10 min,12 000 r/min离心5 min,吸取15.0 mL上清酒液,加入l.0 mol/L的KOH溶液9.0 mL,充分混匀振荡5 min,12 000 r/min离心5 min。使用移液枪吸取适量经离心处理的上清酒液,根据GABA标准曲线的绘制方法,测定酒样的OD值,计算GABA含量[24-25]。

1.4 数据处理

单因素试验数据处理采用Origin10.5.1软件进行图形绘制,并对结果进行综合分析;均匀设计试验数据处理采用MATLAB软件2019中的神经网络工具箱、动态仿真和优化控制工具箱,进行BP神经网络的模型建立、试验数据的仿真模拟及最优参数的预测。

2 结果与讨论

2.1 GABA标准曲线绘制结果

根据GABA标准曲线制作方法,建立γ-氨基丁酸浓度和吸光度值之间的关系曲线,结果见图1。

图1 GABA标准曲线Fig.1 The standard curve of GABA

以GABA浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程y=4.7748x-0.0032,R2=0.9987。

2.2 单因素试验结果及分析

2.2.1 麦曲用量对红小米黄酒GABA含量影响

麦曲用量对红小米黄酒中GABA含量的影响见图2。

图2 麦曲用量对GABA含量影响Fig.2 Effect of wheat starter dosage on GABA content

由图2可知,麦曲用量为5.5%~10.0%时,随着麦曲用量增大,霉菌菌群所产糖化酶量不断增加,并与酿酒曲中的α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶及根霉所产糖化酶共同作用,将红小米中淀粉降解,为酿造体系中的微生物菌群提供更多碳源,微生物在增殖及代谢过程中,通过GABA合成代谢途径关键酶谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)产生大量 GABA,黄酒醪液中GABA含量不断增加;麦曲用量为10.0%时,红小米所含淀粉水解达到饱和,微生物通过GAD合成GABA与通过γ-氨基丁酸转氨酶(γ-aminobutyric acid transaminase,GABA-T)及琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)对GABA进行转化的速率处于动态平衡,继续增大麦曲用量,黄酒醪液中GABA含量增加也不明显。

2.2.2 酿酒曲用量对红小米黄酒GABA含量影响

酿酒曲用量对红小米黄酒中GABA含量的影响见图3。

图3 酿酒曲用量对GABA含量影响Fig.3 Effect of brewing raw starter dosage on GABA content

由图3可知,酿酒曲用量为0.30%~0.40%时,随酿酒曲用量增大,酿酒曲中根霉菌所产糖化酶量逐渐增加,协同酿酒曲中的α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶及麦曲中霉菌所产糖化酶,将红小米所含淀粉降解,微生物可获得足够碳源,迅速增殖。通过菌体代谢,在GAD作用下产生大量GABA,黄酒醪液中GABA含量不断增加;酿酒曲用量增加至0.40%时,红小米所含淀粉水解达到饱和状态,微生物的生长速率处于稳定状态,GABA通过GAD的合成速率与通过GABA-T及SDH的转化速率处于平衡状态,继续增大酿酒曲用量,对黄酒醪液中GABA含量的影响也不大。

2.2.3 前发酵温度对红小米黄酒GABA含量影响

前发酵温度对红小米黄酒中GABA含量的影响见图4。

图4 前发酵温度对GABA含量影响Fig.4 Effect of pre-fermentation temperature on GABA content

由图4可知,前发酵温度为19℃~28℃时,黄酒醪液中GABA含量随前发酵温度升高逐渐增加。可能是前发酵温度较低时,麦曲及酿酒曲中微生物增殖缓慢,GAD活性较低,产生的GABA量较少;随前发酵温度升高,菌体代谢活动加快,GAD活性增强,产生GABA量逐渐增加。前发酵温度高于28℃时,麦曲及酿酒曲中微生物快速增殖,释放大量生物热,醪液升温迅速,菌体发生早衰,不利于GABA积累,黄酒醪液中GABA含量随前发酵温度升高而下降。

2.2.4 前发酵时间对红小米黄酒GABA含量影响

前发酵时间对红小米黄酒中GABA含量的影响见图5。

图5 前发酵时间对GABA含量影响Fig.5 Effect of pre-fermentation time on GABA content

由图5可知,前发酵时间为3 d~9 d时,随前发酵时间延长黄酒醪液中GABA含量逐渐增大。可能是前发酵时间较短时,红小米所含淀粉未被充分降解利用,碳源供给有限,微生物增殖量少,在GAD作用下产生的GABA量也较少;随前发酵时间延长,红小米所含淀粉被充分水解,碳源供给充足,微生物快速增殖,在GAD作用下产生的GABA量逐渐增加。前发酵时间大于9 d时,由于微生物通过缓慢的呼吸代谢,使GABA在GABA-T及SDH的作用下继续转化生成琥珀酸,进入三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle),黄酒醪液中GABA含量随前发酵时间延长有所下降。

2.2.5 后发酵温度对红小米黄酒GABA含量影响

后发酵温度对红小米黄酒中GABA含量的影响见图6。

图6 后发酵温度对GABA含量影响Fig.6 Effect of post-fermentation temperature on GABA content

由图6可知,后发酵温度为9℃~15℃时,黄酒醪液中GABA含量随后发酵温度升高逐渐增加。可能是后发酵温度较低时,酿造体系中微生物代谢缓慢,GAD活性较低,生成的GABA量较少;随后发酵温度升高,菌体代谢速率有一定程度增大,GAD活性增强,产生GABA量有所增加。后发酵温度高于15℃,后发酵前期发酵速度过快,酒精迅速积累,抑制菌体内参与GABA合成代谢的关键酶GAD的活性,同时酿造体系中细菌的代谢活动受到抑制,醪液总酸含量较少,进一步降低GAD活性,黄酒醪液中GABA含量随后发酵温度升高快速下降[26]。

2.2.6 后发酵时间对红小米黄酒GABA含量影响

后发酵时间对红小米黄酒中GABA含量的影响见图7。

图7 后发酵时间对GABA含量影响Fig.7 Effect of post-fermentation time on GABA content

由图7可知,后发酵时间为25 d~65 d,黄酒醪液中GABA含量随后发酵时间延长逐渐增加。可能是由于从后发酵前期到中期,罐内逐渐处于厌氧环境,抑制GABA分解代谢途径中的GABA-T及SDH活性,同时醪液中总酸含量上升,pH值下降,GAD活性增强,不断积累GABA;后发酵后期,酿造体系中微生物菌体发生自溶,GABA被逐步释放,GABA含量随后发酵时间延长逐渐增加。后发酵时间大于65 d时,GABA已被充分释放,随后发酵时间继续延长,黄酒醪液中GABA含量变化不大。

2.3 均匀设计试验结果

根据均匀设计试验因素水平表的安排进行试验,具体结果见表2。

表2 均匀设计试验结果Table 2 The results of uniform design experiment

以均匀设计试验的结果数据作为BP神经网络的训练样本,利用MATLAB软件,建立BP神经网络,神经网络训练过程的均方误差变化曲线如图8所示。

图8 BP神经网络训练过程均方误差变化曲线Fig.8 The mean square error variation curve of BP neural network training process

由图8可知,经持续学习训练,BP神经网络训练均方误差逐渐减小,当训练8 489次时,BP神经网络均方误差为0.000 499 1,小于设定值0.001,神经网络收敛,训练结束。

随机选择均匀设计试验结果中的3组数据,输入训练后的BP神经网络,将网络预测输出值与实测值进行对比,如图9所示。

图9 3组随机选择实测值与BP神经网络预测值对比Fig.9 The three groups randomly selected and measured values compared with the predicted values of BP neural network

由图9可知,预测值和实测值比较接近,故可利用训练后的BP神经网络预测红小米黄酒在不同酿造工艺参数情况下,黄酒醪液中GABA含量。

遗传算法对训练后的BP神经网络最优预测值的求解轨迹,如图10所示。

图10 遗传算法寻优求解轨迹Fig.10 The optimizing and solving trajectory of genetic algorithm

由图10可知,当遗传、交叉、变异、复制进行200代,遗传算法优化求解得出的最大适应度值(即GABA最高含量)为0.138 7 mg/mL,此时,与最大适应度值(GABA含量)相对应的红小米黄酒酿造工艺参数为麦曲用量10.35%,酿酒曲用量0.42%,前发酵温度24.31℃,前发酵时间6.42 d,后发酵温度14.22℃,后发酵时间70.16 d。

为便于实践操作,将上述酿造工艺参数进行适当修正如下:麦曲用量10.35%,酿酒曲用量0.42%,前发酵温度24℃,前发酵时间6 d,后发酵温度14℃,后发酵时间70 d。根据修正后的酿造工艺参数酿造3罐红小米黄酒,测得黄酒醪液中GABA含量平均值为0.139 8 mg/mL。结果比BP神经网络预测最优值稍大,说明修正后的酿造工艺参数具有较强的工程实践意义,可按此工艺参数进行富含GABA红小米黄酒的酿造。

3 结论

在单因素试验基础上,进行均匀设计试验,利用MATLAB软件,以均匀设计试验数据为训练样本,采用BP神经网络建立了红小米黄酒酿造工艺参数与GABA含量之间关系的数学模型,利用模型可对在不同酿造工艺参数组合条件下红小米黄酒中GABA含量进行高精度预测。

采用遗传算法对训练后的BP神经网络最优预测值(GABA含量最高)及相应的红小米黄酒酿造工艺参数进行优化求解,并结合工程实际适当修正,确定富含GABA的红小米黄酒较优酿造工艺参数为:麦曲用量10.35%,酿酒曲用量0.42%,前发酵温度24℃,前发酵时间6 d,后发酵温度14℃,后发酵时间70 d。在此条件下酿造的红小米黄酒,GABA含量可达0.1398mg/mL。

文中主要对富含GABA的红小米黄酒酿造工艺参数进行了优化,但红小米黄酒酿造过程中GABA含量的动态变化及GABA合成的代谢调控还有待于进一步研究。

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