苟浩琦，马常凯，张迁，范术丽，马启峰，张朝军

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物学国家重点实验室，河南安阳 455000）

雄性不育在植物界中较为普遍，可遗传的雄性不育分为染色体型和基因型。 染色体型主要是由远缘杂交引起，导致子代表现出雄性不育的性状。基因型雄性不育又可分为核质互作雄性不育型和细胞核雄性不育型[1]，在棉花中均有发现。棉花细胞质不育系主要有哈克尼西棉胞质不育系[2-3]、亚洲棉胞质不育系、异常棉胞质不育系[4-5]、三裂棉胞质不育系[6]、陆地棉胞质不育系和海岛棉胞质不育系，我国杂交棉育种中应用较多的是哈克尼西棉胞质不育系。 由于应用不育系的强优势组合选配困难， 虽然有品种审定， 如中棉所99[7]，但未在生产上大面积应用。 已报道的棉花核不育系有17 个不同类型， 包括9 个隐性核不育系，分别是ms1、ms2、ms3、ms5ms6、ms8ms9、ms13、ms14、ms15和ms16[8-9]；8 个 显 性 核 不 育 系，分 别 是Ms4、Ms7、Ms10、Ms11、Ms12、Ms17、Ms18以及Ms19[10]。棉花隐性核不育系在制种应用中要拔除50%的可育株，严重影响制种效率，因此在生产上应用较少。

环境敏感型核不育（Environment-sensitive genic male sterile，EGMS）是一种特殊的核不育系类型，参与植物的光形态建成、 开花和昼夜节律调控等[11]。 20 世纪70 年代我国首先发现了光温敏感型水稻不育材料[12]，开启了两系杂交稻的生产应用。 水稻中曾发现多种温敏核雄性不育材料，如安农S-1、广占63S 等，已发现的基因主要有tsm1、tsm2、tsm3、tsm4、tsm5、tsm6等[13-14]。光敏雄性不育水稻主要有农垦58S、培矮64S，主要光敏不育基因有pms1、pms2、pms3、pms5等[15]；另外，还发现了反式光敏不育系、反式温敏不育系等材料[16-17]。 此后，由温度、光周期调控的雄性不育材料在大麦、玉米、高梁、油菜等作物中被发现。 在玉米中报道了光敏、温敏不育系[18]；小麦中报道了光敏[19]、温敏[20]、光温敏[21]核不育系；大麦中发现光温敏核雄性不育系[22]；在谷子[23]、高粱[24]、油菜[25]等作物中也发现了光温敏雄性不育系；茄子有反向热敏感雄性不育系[26]。 分子研究发现长链非编码RNA （Long non-coding RNAs，lncRNA）、 小RNA 和功能基因参与了环境敏感型育性调控[27]。

棉花环境敏感型核不育系的研究刚起步，还未在生产上大面积应用。 在我国的主要棉区，棉花在花期和花铃期容易受到极端高温天气的影响，引起棉花花粉败育，不能正常授粉，从而造成蕾铃脱落[28]。 湖南农业大学培育出棉花温敏雄性不育系特棉S-1，在日平均温度高于27 ℃时表现为不育[29]。 还有诸多棉花温敏不育系已被发现，如TMS-2[30]、48043[31]、洞A[32]，此外还选育了对光温敏感的雄性不育系如光温A[33]和湘QB[34]。 中国农业科学院棉花研究所（简称：中棉所）喻树迅院士团队利用航天诱变育种技术，培育新型的棉花芽黄光敏雄性不育突变体中9106。 马建辉等[35]研究发现，中9106 在光照时间为13～14.5 h 的长日照条件下花粉败育，能配制杂交组合，生产杂交种； 在光照时间为11～12.5 h 的短日照，且日平均温度大于等于21.5 ℃的条件下可育，可在短日照高温地区自交繁殖。 张朝军通过棉花组织培养体系利用陆地棉W10 创制了棉花光敏雄性不育突变体psm4[36]，遮光试验表明其在日照时间大于12.5 h 条件下表现为花药不开裂、花粉发育正常的雄性不育性状；小于11.5 h 表现为花药可以开裂、能正常散粉的雄性可育性状，是典型的棉花孢子体光敏不育系。以psm4 为母本，W10 为父本，得到具有光敏不育特性，但是有正常的花粉壁、花粉活力正常的光敏不育系psm5。 本研究将结合亲本的特性详细介绍psm5的特性及其育性的转变规律。

1 材料与方法

1.1 试验材料与地点

W10 和psm4[31]来源于中棉所转基因创新小组。psm4是W10 无菌苗下胚轴组织培养获得的突变体。 利用psm4与W10 杂交，在127 株F2后代中发现12 株生长健壮的雄性不育植株。 将不育株的果枝嫁接到W10 砧木上， 移入安阳工学院人工气候室， 在光周期为11.5 h（光）/12.5 h（暗）、 昼夜温度为35 ℃/20 ℃的条件下生长结铃。 同年将种子在海南三亚中棉所南繁基地扩繁。次年3 月底分单株收获自交种。一部分种子在河南省安阳县中棉所试验农场种植， 与正常棉花同样种植管理，观察育性。一部分种子继续南繁种植，在后代植株中选出结铃性好、花粉量接近W10的株系，命名为psm5。 在安阳市中棉所试验田和安阳工学院人工气候室对psm5进行系统研究。

1.2 育性稳定性试验

2018―2019 年分别在安阳大田进行psm5、psm4育性稳定性试验，以W10 为对照，每个处理1 行，行长8 m，行距0.8 m，株距0.25 m，设置3个重复，管理同大田正常管理模式。 7 月20 日至9 月10 日进行自交，10 月5 日调查自交结铃数。

1.3 花药散粉观察、花药石蜡切片观察及花粉活力检测

在大田选取当天盛开的花朵，用镊子剥去花瓣，暴露出花药与柱头，用体式显微镜Olympus BX51TF 进行观察并拍照。

在大田取W10 开花当天待散粉但仍未散粉的花药，取psm4、psm5开花当天的花药，用甲醛-乙酸-乙醇（FAA）固定液固定24 h，再用体积分数分别为70%、85%、95%、100%的乙醇依次脱水，用二甲苯透明，然后经渗蜡、包埋，最后进行切片（厚度为8 μm），经番红-固绿染色，中性树胶封片，制成永久切片。用Olympus BX51 显微镜观察并拍照。

在大田取样， 分别取W10、psm4及psm5植株开花当天的花药。 W10 植株的花药此时已开裂，可以直接用镊子夹取花药将花粉抖落到载玻片上，吸取100 μL 亚历山大染色剂，滴至载玻片上， 然后盖上盖玻片。 一般1～2 h 后即可用Olympus BX51 光学显微镜观察并拍照。 由于psm4和psm5植株开花当天的花药不开裂，需要用双面刀片将花药切开，以便花粉散出。 切开后，后续步骤同W10 植株的花药处理。

1.4 花粉萌发试验

在大田选取W10 和psm5当天开放的花蕾，利用固体培养基进行花粉萌发试验，具体参考梁满中等[37]的方法。

1.5 光温响应试验

将psm4、psm5和W10 种植在培养钵中，在中棉所露天生长到开花期，各取5 株移入人工气候室进行观察。 2 个人工气候室光周期分别设为12.5 h（光）/11.5 h（暗）、11.5 h（光）/12.5 h（暗），每30 d 转换1 次光周期， 光/暗处理温度分别为35 ℃/20 ℃、25 ℃/15 ℃两个处理，温度误差为±2 ℃。 记录不同温度下育性转变所需时间。

2 结果与分析

2.1 psm5 的育性稳定性

大田取样观察发现：W10 花药正常开裂，有大量花粉散出；psm5和psm4花药不开裂， 无花粉散出（图1）。可见，psm5保持了psm4在安阳花药不开裂的特性。2018―2019 年连续2 年在安阳自交， 均未得到psm5的自交铃， 说明psm5与psm4一样具有稳定的雄性不育特性。

2.2 psm5 与psm4 花药及花粉的区别

在开花当天取花药做石蜡切片，观察成熟的花粉状态及花药裂口组织状况。W10 花药壁箭头部位可见即将开裂的花药裂口组织， 而psm5和psm4的裂口组织无开裂的迹象。psm5和W10 的花粉粒上可见正常的刺凸， 花粉发育正常；psm4的花粉粒上无刺凸，畸形花粉较多，其可能是由于花粉粒无包被保护，在固定液浸泡过程中内部细胞质从裸露的萌发孔渗出导致的（图2A～C）。染色结果表明， 与W10 花粉相比，psm4和psm5的花粉染色略浅，活力稍低，且psm4存在畸形的花粉粒（图2D～F）。 由此可知，psm5的花药具有花粉粒包被， 但同样呈现出与psm4相同的花药不开裂特性。

2.3 psm5 与W10 的离体花粉萌发活力分析

psm5与W10 的花粉萌发试验结果表明：psm5的花粉萌发率（34.48%）与W10 的花粉萌发率（45.79%）存在显著差异；与W10 相比，psm5花粉活力较弱，但仍有一定的活力。

2.4 psm5 与psm4 育性转变规律

从4 月28 日出苗至7 月上旬开花， 安阳的光照时间为13.5～14.5 h。 将开花期的psm5、psm4植株移入昼夜温度为35 ℃/20 ℃的人工气候室， 在12.5 h/11.5 h 光周期条件下培养30 d。W10 的花药正常开裂散粉，能自交结铃；psm5和psm4的花药不开裂，保持雄性不育性状，自交不结铃。 光周期转变为11.5 h/12.5 h 时，W10 的花药仍正常开裂散粉；10 d 后，psm5和psm4个别单株花朵中少量花药开裂、 散粉； 到15 d 时，psm4、psm5所有单株均表现为花药开裂、正常散粉。 到第30 天将光周期重新调回12.5 h/11.5 h，12～16 d 后，2 个不育系植株花药由开裂状态重新转化为不开裂状态。 30 d 后重新调整回11.5 h/12.5 h，12 d 后psm5、psm4逐渐开裂散粉（表1）。W10 的花药在转换期间始终保持正常散粉状态。psm4和psm5在花粉开裂散粉期间均能自交结铃。

表1 不同温度和光周期条件下psm4 与psm5 育性转变规律Table 1 The fertility transition characiers of psm4 and psm5 under different temperature and photoperiod conditions

将开花期的psm5、psm4植株移入25 ℃/15 ℃条件下的人工气候室， 在12.5 h/11.5 h 光周期条件下培育30 d，2 个材料花药均不开裂，保持雄性不育性状，与在35 ℃/20 ℃条件下的人工气候室表现相同。当光周期转变为11.5 h/12.5 h 的第15天，有的单株花药开始开裂、散粉。 第22 天，所有单株均表现为花药开裂、正常散粉。 第30 天，将光 周 期 重 新 调 回12.5 h/11.5 h，15 ～23 d 后，psm4、psm5的花药重新转化为不开裂、不散粉状态。 30 d 后重新调整光周期为11.5 h/12.5 h，15 d后psm5、psm4逐渐恢复花药开裂、 散粉状态（表1）。W10 的花药始终正常开裂并散粉。在花粉开裂散粉期间，psm4和psm5仍能自交结铃。

3 讨论

psm4与姊妹系W10 杂交， 获得了psm5光敏不育系。psm5不育系花粉粒有发育正常的花粉包被， 说明psm4光敏不育性状与无花粉包被无关。 在不同温度条件下进行光周期转换试验，说明psm5、psm4光敏不育特性不受温度影响。在低温下育性转换时间延长，可能与低温下蕾发育变慢有关。 在安阳大田连续2 年种植psm4和psm5， 直到霜降后也没有发现花药开裂的现象；在三亚大茅温室中和气温达到40 ℃以上的夏季大田，psm5和psm4均保持雄性不育特性。 结合人工气候室育性转换试验， 可以认定psm4和psm5的花药不开裂性状不受温度影响， 仅受光周期诱导，是典型的光敏不育系。 同时，也首次证明了光周期对棉花花药开裂有调控作用。

由于我国各主要植棉区棉花正常生长阶段日照时间均大于12 h，psm5在这些棉区均表现为雄性不育。 本研究中对于2 个光照时间节点（12.5 h 和11.5 h）的选择，主要基于三亚光周期的限制。 因为10 月份三亚光照时间从12 h 转变为11.5 h，此时棉花正值苗期；2 月中旬到3 月中旬棉花吐絮期， 光照时间从11.5 h 转变为12 h。3－10 月份，psm4、psm5在三亚田间均表现为雄性不育。 关于psm4与psm5在11.5～12.5 h 光照条件下的育性及其具体响应周期还应深入研究。加强对这2 种光敏不育材料的分子试验，探讨光周期与花药开裂之间的调控机制，为光敏雄性不育系的应用奠定坚实的理论基础。

psm5作为棉花光敏雄性核不育材料， 与之前报道的光敏不育材料中9106 在表型及光敏特性方面均有明显的不同。 中9106 的雄性不育表型为花药不开裂，花粉无活力[35]；而psm5花药不开裂， 其花粉活力与野生型花粉相比较弱，但仍可萌发。 在光敏特性方面，中9106 在长日照条件（13～14.5 h）下花粉败育；在短日照（11～12.5 h），且日平均温度大于等于21.5 ℃的条件下可育[35]。而psm5在日照时间大于12.5 h 时不育， 在日照时间小于11.5 h 时可育，且不受温度影响。 因此，psm5作为两系法制种材料具有更大的应用潜力。

4 结论

棉花光敏不育系psm4的育性是由花药不能正常开裂引起的， 与花粉粒外包被发育缺陷无关。psm4棉花花药不开裂性状受光周期控制，与温度无明显关系。 在低温下花药开裂性状转变所需时间较长，推断是低温下花蕾发育进程变慢所致。从psm4和psm5育性转变时间推断其花药在长日照条件下不开裂的性状，是在棉蕾发育中后期形成的，与蕾前期发育和花粉发育无关。 本研究证明psm4花粉粒包被缺失与花药不开裂的光敏不育性状是2 个独立遗传性状。 利用杂交技术可以将2 个性状分离，培养花粉粒正常的光敏不育系psm5。psm4和psm5是典型的孢子体光敏不育系材料。psm5的创制对揭示棉花光敏不育机理和育种应用具有重要意义。