李可维 张宏超 刘海晶 孙莉 张雪

摘要：根据发酵原料药生产要求，对维生素C生产所用的发酵罐进行灭菌工艺验证，通过热分布测试确认发酵罐的温度分布，通过微生物挑战实验确认发酵罐的无菌状态。

关键词：发酵罐 热分布测试 微生物挑战实验

1 引言：

在维生素C发酵生产前需要保持确保空发酵罐的无菌状态，依据制药行业规范和GMP对发酵罐空消灭菌过程实施热分布测试和微生物挑战实验。从而实现发酵过程的无菌纯培养，降低发酵液染菌的风险，保证产品质量和生产效益。

2 GMP发酵罐的主要技术参数

（1）发酵罐工作体积为200m3。

（2）发酵罐由罐体，管路和控制系统组成。

（3）能够准确控制搅拌速度、空气流量和培养温度，能够精确测量温度、pH值和空气流量。

（4）发酵罐为上搅拌发酵罐，采用双端面机械密封，具有良好的密封性能。

（5）无菌空气采用双级过滤器进行除菌过滤，过滤效率高，能够耐受蒸汽灭菌。

（6）罐体和管路均采用304不锈钢制作，接触液体表面经过抛光处理，罐体具有零死角接种阀、取样阀和底阀。

3 实验仪器、耗材

3.1 WL-T1無线温度验证系统

型号 WL-T1通用型

感温元件 PT1000

测量范围 -60℃至150℃

精度 ±0.1℃

分辨率 0.01℃

记录仪材质 316L不锈钢

3.2生物指示剂

生产商：美国3M公司 型号：Attest 1262-S生物指示剂（蒸汽）

D值（121℃）：1.5～3.0分钟 菌种：ATCC7953嗜热脂肪地芽孢杆菌

培养温度：56℃±2℃ 孢子量：1.0×106～9.9×106

Z值：≥6℃ 储存条件：15～30℃，35%～65%RH

3.3可扩展试验箱

设备型号：BXS-250 设备容积：250L

电源电压：220V/50Hz 控温范围：0～70℃

出厂日期：2019年08月20日 出厂编号：190020

生产商：上海博迅实业有限公司医疗设备厂

3.4 高精度数字温度计

设备型号：IPRT-1 出厂编号：19071829

量程：-200℃～500℃ 校验周期：1年

校验日期：2020年08月26日 下次校验：2021年08月25日

生产商：深圳市研工科技有限公司

3.5 恒温油槽

设备型号：CJTH-300A 设备出厂编号：8687

工作温度范围：90℃～300℃ 温度波动度：±0.01℃

温度均匀度：±0.01℃ 生产厂家：湖北唯立仪表厂

4验证方案设计

4.1无线温度验证系统前校准

开机前检查油槽内硅油液位是否在加热管之上，检查无误连接电源。判断标准处判定时间设置3分钟，偏差要求值设置0.5℃。校准低点设置为110℃，高点设置为140℃，校验点设置为125℃。设置后将无线记录器和标准温度计放置在恒温油槽内。停止倒计时后，取出无线记录器充分冷却后擦干无线记录器表面的水分，上传无线记录器的数据。完成校准过程。

校准结束后查看原始校准数据，查看温度波动、补偿值、偏差值是否有异常情况，在温度校准报告的最后一页查看校准是否通过。

4.2空消热分布测试

（1）热分布测试策略：

发酵罐是维生素C发酵设备，为确保持续稳定的微生物发酵需要，采用空消灭菌工艺，需进行热分布测试。发酵罐在日常灭菌过程中，使用空消灭菌程序，在进行发酵罐验证时将开展对应的灭菌程序测试和生物挑战。基于生产工艺流程，发酵罐的空消灭菌工艺条件为（125℃/70min）。本次为该灭菌程序在该设备上的首次验证，因此验证方案设计为连续测试3次。

（2）热分布测试风险分析

空消灭菌工艺本身的风险;温度不能达到灭菌条件要求;温度不均一（可能由于进汽程序、排汽/气程序、设备结构造成的局部冷点）;灭菌时间不够;空气热传导和金属热传导速度的差异造成灭菌时间的差异;

（3）热分布布点风险控制策略：

根据灭菌对象的空间几何形状进行布点，以识别空间几何形状对温度分布的影响;根据罐体内灭菌对象进行布点，以识别灭菌对象性质差异造成对温度分布的影响;根据进汽点位置进行布点，以评估进汽点温度（可能的高温点）可能对灭菌效果影响;根据排汽点（疏水）进行布点，以评估排汽点温度（可能的低温点）可能对灭菌效果的影响;

布置15根温度探头，其中1#至12#探头分别固定在发酵罐的上中下3层，按照罐体高度平均分为上中下三层，每层4个点，周边每120度一个，1#、5#、9#为各层的中心点;

13#置于上封头顶部空间中心位置;

14#置于罐底排放管道位置;

15#至放置在发酵罐温度控制探头处，

根据内壁部件选择发酵罐的适当位置进行固定（盘管、挡板、搅拌器转轴），如无适当依托则制作相应的内部托架;

（4）热分布测试接受标准

在灭菌阶段各点的累积F0值要求≥15为合格;

在灭菌阶段，所有传感器的温度值均达到125℃;保压时间达到70min。

（5）热分布测试接受导出测试结果后，参照前校准对无线温度验证系统实施后校准。

4.3生物挑战测试

（1）生物指示剂确认：选用嗜热脂肪地芽孢杆菌ATCC7953;孢子量符合1.0×106～9.9×106cfu/条的标准

（2）生物指示剂放置要求：生物指示剂和无线温度探头同时进行布点。

（3）生物指示劑使用方法：

按照布点图分别将生物指示剂放在发酵罐内不同位置，启动灭菌程序进行灭菌。灭菌完毕，取出该生物指示剂。挤破内含的安瓿，与一支阳性对照管一起放于56℃培养箱内培养，48小时后观察培养结果。

（4）生物挑战测试可接受标准

阳性对照：培养后阳性对照指示管应有微生物生长，即培养基颜色呈黄色，则该次试验有效。培养后阳性对照指示管标签仍呈现粉红色。

蒸汽灭菌后的生物指示剂：培养后经灭菌的所有生物指示剂保持紫色为无菌生长，判定为灭菌合格。培养后经灭菌的所有生物指示剂标签从粉红色变成棕色。

5 验证结果分析

（1）无线温度验证系统校准结果分析

前校准及后校准均一次性通过，在校准温度点无线探头和标准温度计的最大偏差为0.02℃，远小于0.5℃的偏差要求，说明无线温度验证系统和恒温油槽的稳定性较高，其稳定性和国外同类产品一致。

（2）热分布结果分析

对三次热分布测试的灭菌保持阶段的最低温度、灭菌保持阶段的时间和累积的F0值进行统计。

2：热分布测试关键数据汇总表

三次热分布测试的灭菌段最低温度均大于设定的灭菌可接受标准中的125℃，且三次热分布测试灭菌段最低温度极差为1.41℃。三次热分布测试灭菌段最高温度极差为0.63℃。三次热分布测试的灭菌阶段时间均为70min。最小累积F0值远大于可接受标准15，且三次热分布测试最小累积F0值极差为20.22。说明灭菌程序热分布测试达到了预定目标，灭菌程序的重复性较好。

（3）微生物挑战结果分析

所使用的生物指示剂信息：

生产商：3M 型号：1262-S 生产批号：333K3W

菌种：ATCC7953 孢子量：4.6×106CFU D值（121℃）：2.1min

存活时间：9.79min 杀灭时间：22.39min Z值：15℃

生产日期：2020年10月29日 有效期：2022年10月28日

每次灭菌测试结束后，罐体完成降温后将生物指示剂与无线记录仪一起取出，将指示剂中的培养基玻璃小瓶捏碎后，将生物指示剂放在生化培养箱中，在56℃的条件下培养48小时候观察培养结果，三次灭菌的生物指示剂全部符合灭菌要求（呈深蓝色），阳性呈现黄色，达到了灭菌验证方案中的预定要求。

参照美国注射剂协会编写的第61号技术报告《在线灭菌》中关于生物挑战的分析，计算生物F0值如下：

FBIO=DT×SLR（孢子下降对数）

FBIO=DT×（logN0-logNF）

=2.1×（log4.6×106-log100）

=13.99

说明生物挑战实验已达到了过度杀灭（FBIO为12）的灭菌水平，灭菌条件能够保证发酵罐的无菌条件下纯培养要求。

6 结果讨论

验证实施前进行了多次的灭菌参数调试，以确保灭菌参数能够符合灭菌工艺要求，在此强调良好的调试是灭菌验证的成功的保证，没有一个万能的参数能够满足不同要求，一定要结合自身的实际情况去摸索符合自身实际情况的控制参数，也是基于此点本文并未列出非常具体的灭菌参数。本文的最大价值为制药行业同仁提供一个可供参考的案例进行分享。

参考文献

[1]《中国药典2020年版》9207灭菌用生物指示剂指导原则

[2]GBT 19972-2018医疗保健产品灭菌 生物指示剂选择、使用和结果判断指南

[3]USP42-NF37 <1229.1> Steam Sterilization by Direct Contact

[4]Parenteral Drug Association Technical Report No.61 Steam In Place

作者简介：李可维 1986.05.13 男 吉林省榆树市 汉族 大学本科 助力工程师 从事药品质量管理