姚喜喜， 才 华， 刘皓栋， 李长慧*

(1. 青海大学农牧学院， 青海 西宁 810016； 2. 青海省泽曲林场， 青海 黄南 811400；3. 甘肃畜牧工程职业技术学院， 甘肃 武威 733006)

生育时期是影响牧草营养品质的一个重要因素，天然草原缺乏人为管理，如施肥、灌溉、除杂草、防病虫鼠害等，所以生育时期对天然牧草的影响显得尤为关键[1]。随着牧草的生长发育，牧草的养分含量和消化率也会出现不同程度的变化。对青藏高原高寒牧区牧草而言，因其独特的生态环境条件，夏季牧草营养价值显著高于冬季和春季[1]，据报道，夏季牧草表现出粗蛋白质和瘤胃消化率较高，而粗纤维含量较低的现象[2-3]。郝力壮等[4]和林莉等[5]分别研究了青海三江源区不同草地、不同生育时期牧草综合营养品质和草地合理载畜量，当生育时期处于枯草期时，牧草中的磷和粗蛋白含量较少，因此能为家畜提供的营养物质有限。有研究对青海牦牛冬季饲喂粗饲料和5种天然牧草进行组合来探究体外发酵变化，发现体外发酵参数与底物营养成分具有相关性[6]，理想状态下，气体产量与CP成正比，与ADF，NDF成反比；乙酸、丙酸的含量以及CH4含量都与粗蛋白成正比，其中CH4含量也与酸性、中性洗涤纤维成正比。樊金富和金海[7]运用饱和链烷烃法，检测了牧草在3个不同时期时，奶牛DMI和DMD以及牧草营养成分含量，发现幼嫩期牧草CP含量最高，旺盛期GE含量最高，枯黄期NDF，Ca和P最高，牧草幼嫩期与旺盛期的干物质采食量和消化率都优于枯黄期。Niwinska等[8]通过研究发现，不同季节紫花苜蓿(MedicagosativaL.)营养成分不同是因为不同季节下紫花苜蓿的营养物质化学组分和结构及其消化过程均存在差异。青藏高原牧草在5—10月份正值生长期，土壤中的养分也因为季节的不同呈现出不同变化[9]。牧草的生长发育会表现出由返青期到枯黄期的季节性变化规律，返青过程中牧草的营养含量最高，生长期结束后，牧草的成熟和木质化进程开始，营养价值开始下降[10]。

温室效应最大的影响因素就是二氧化碳的排放量，然而CH4排放引起的温室效应同样不容小觑。虽然CH4的排放量比二氧化碳少，然而其造成的温室效应却远高于二氧化碳，全球由CH4排放造成的温室效应占到了20%[11]。据相关数据统计，反刍动物每年排放的CH4占全球人类活动CH4排放总量的6%[12]。CH4气体过多排放会对大气和生态环境造成威胁，CH4是能量的载体物质，减少其排放，不仅能够提高营养物质的利用效率和减少温室效应，还能提高动物生产性能[13]。本研究则是基于青藏高原玛曲县高寒草甸为研究对象，通过采集不同生育时期的牧草进行牦牛瘤胃体外发酵试验，测定其瘤胃内CH4产量，为准确评估放牧牦牛CH4排放提供研究基础。

自20世纪80年代青藏高原草原资源科考以来[14]，对天然草地自然生长牧草的营养价值动态变化的研究较少，而且研究多集中于国外，目前国内对天然草地牧草相关方面的研究主要集中在甘肃、西藏和内蒙古等地区，对青海海北州祁连县相关方面的研究较少。鉴于上述，本试验通过系统研究青藏高原高寒草甸草原不同生育时期天然牧草品质、牦牛瘤胃体外发酵参数及CH4排放动态，以期为高寒牧区牦牛合理放牧和减缓CH4排放，减少温室气体排放，实现高寒草地畜牧业可持续发展提供理论支撑。

1 材料及方法

1.1 研究区概况

研究地区位于青海省海北藏族自治州祁连县(100°55′E,37°57′N)，属典型的高原大陆性气候，温差较大，冬春季长而寒冷，夏秋季短，平均海拔3 169 m，年平均降水量420 mm，约85%的降雨量主要集中在牧草生长季的5—10月份，平均气温在1℃，其中最高温度与最低温度分别为8℃和-3℃。草地类型属高寒草甸，以矮生嵩草(Kobresiahumilis)、针茅(StipacapillataLinn.)、早熟禾(PoaannuaL.)和披碱草(ElymusdahuricusTurcz.)为优势种牧草，土壤为亚高山草甸土。

1.2 试验设计

本研究以10头3岁牦牛全年放牧的轻度退化高寒草甸(面积24 hm2)为研究对象，放牧强度为轻度放牧(2.0个羊单位·hm-2)，分别在牧草返青期(2020年5月12日)、青草期(2020年8月8日)和枯草期(2020年12月5日)3个生育时期选择代表性样地，利用标准草地调查样方(0.5 m × 0.5 m)随机选取15个样点进行草地调查，3个不同的牧草生育时期草地调查信息如表1所示。牧草样品留茬高度为2～3 cm，收集样方内全部牧草，筛选出可食用和无毒的牧草放置于阴凉处，再装袋带回实验室，在105℃烘箱中恒温杀青0.3～0.5 h，后将所有样品在65℃烘箱中恒温烘24 h至恒重，开始进行粉碎工艺，过40目筛选，之后装于6号自封袋，进行密封保存。

表1 草地植被组成Table 1 Composition of grassland vegetation

1.3 瘤胃液样品采集与体外发酵设计

在10头牦牛晨饲前，运用口腔导管法采集瘤胃液样品，每头约采集200～300 mL，共采集瘤胃液2 000～3 000 mL，将采集好的瘤胃液通过四层纱布过滤后，保存到事先已通入过量CO2且经(39±0.5)℃预热的暖瓶中，整个操作在30 min内完成。将采集好的瘤胃液迅速转移带回实验室备用。

人工缓冲液的配制参照Menke和Steingass的方法，分别由微量元素A溶液、缓冲液B溶液、常量元素C溶液、指示剂D溶液和还原剂E溶液按474 mL蒸馏水+0.12 mL溶液A+237 mL溶液B+237 mL溶液C+1.22 mL溶液D+50 mL溶液E配置而成。微量元素A溶液由13.2 g CaCl2·2H2O，10.0 g MnCl2·4H2O，1.0 g CoCl2·6H2O和8.0 g FeCl3·6H2O加蒸馏水定容至50.00 mL组成。缓冲液B溶液由4.0 g NH4HCO3和35.0 g NaHCO3加蒸馏水定容至500.00 mL组成。常量元素C溶液由5.7 g Na2HPO4，6.2 g KH2PO4和0.6 g MgSO4·7H2O加蒸馏水定容至50.00 mL组成。指示剂D溶液由100 mg C12H7NO4和100 mg刃天青加蒸馏水定容至50.00 mL组成。还原剂E溶液由4 mL 1 mol·L-1NaOH和0.625 g Na2S·9H2O加蒸馏水定容至50.00 mL组成。将配置好的人工缓冲液混合后水浴加热至39℃，通入CO2使混合营养液由蓝色变为粉红色直至无色，最后将混合营养液与瘤胃液以2∶1体积比混合，即为培养液[15]。

体外产气装置采用美国ANKOM RFS型全自动体外产气记录仪。每个牧草样品设置3个重复，每个重复准确称取样品0.500 0 g，精确到0.000 1 g，装入相对应编号的体外发酵瓶底部，先在恒温水浴摇床中预热至39℃，通入一定量的二氧化碳来排除氧气，再加入120 mL预热(39℃)的培养液，再次排出O2，将容器放置于水浴摇床中，恒温39℃，维持2 d，期间，记录各发酵时间点(6，12，24，48 h)的产气压力，随后进行CH4产量测定(密封气体进样针采集5 ml发酵瓶上部气)，在设定时间点取出对应发酵瓶，立即放入事先准备好的冰水中，目的是终止其发酵，将发酵瓶中的液体进行瘤胃发酵参数测定，收集残渣用于体外消化率测定。

1.4 测定指标及方法

采用氧弹式热量计来测定牧草GE；DM和EE分别采用烘干法和索氏抽提法测定[16]；采用全自动凯氏定氮仪(Foss Kheltec 8400)测定粗蛋白含量[17]；使用全自动纤维分析仪(ANKOM 2000 Fiber Analyzer)，采用Van soest纤维分析法测定酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)和中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)[18]；粗灰分(Ash)采用灰化法[16]；矿质元素钙(Ca)采用高锰酸钾法[16]；矿质元素磷(P)采用钒-钼黄比色法[16]。

对于体外消化率测定：准确称取样品(1.000 0 g)放入已知重量的尼龙袋中(400目；3.0 cm×5.5 cm)，每个样品设置3个重复。将装有样品的尼龙袋放入发酵罐中，同时设置空白对照和标准苜蓿组来消除系统误差，将各发酵罐放入体外培养箱中预热至39℃，取出后通入二氧化碳，每个发酵罐装入1 600 mL预热(39℃)的培养液(无色状态)，通入二氧化碳排出氧气再放入培养箱中进行培养(39℃)，培养48 h后取出尼龙袋，立即放入冷水中，终止其发酵，然后用39℃温水对其进行细流冲洗，直到尼龙袋表面干净为止，将其放于瓷盘中进行烘干至恒重，差减法计算样品干物质消化率(Dry matter digestibility，DMD)，将3个重复样品粉碎混合均匀，用常规营养分析方法进行测定酸性洗涤纤维消化率(Acid detergent fiber digestibility，ADFD)、粗蛋白消化率(Crude protein digestibility，CPD)、中性洗涤纤维消化率(Neutral detergent fiber digestibility，NDFD)、有机物消化率(Organic matter digestibility,OMD)[17-18]。本试验采用标准苜蓿作标准对照，测得标准苜蓿的消化率后计算校正系数(F)，如DMD计算公式如下。

DMDS—所有试验批次标准苜蓿样品干物质消化率的平均数(%)；

DMDX—每次测试中标准苜蓿样品干物质消化率(%)；

DMD(%)=100×(发酵底物重×DM%-发酵残渣的DM量)/(发酵底物重×DM%)；

OMD(%)=100×(发酵底物重×OM%-发酵残渣的OM量)/(发酵底物重×OM%)；

CPD(%)=100×(发酵底物重×CP%-发酵残渣的CP量)/(发酵底物重×CP%)；

NDFD(%)=100×(发酵底物重×NDF%-发酵残渣的NDF量)/(发酵底物重×NDF%)；

ADFD(%)=100×(发酵底物重×ADF%-发酵残渣的ADF量)/(发酵底物重×ADF%)。

发酵参数、总产气量和CH4产量测定：氨态氮参照Broderick和Kang提出改进的比色法进行测定[19]；气相色谱仪(日本岛津GC-2010 Plus)测定挥发性脂肪酸和CH4产量[20]；累计产气量计算公式为：

Vx=VjPpsi×0.068004084

式中：Vx为产气总体积(mL)；Vj为发酵瓶顶部空间体积(mL)；Ppsi为气体测量系统自动记录的压力(kPa)。

1.5 数据处理

试验数据使用SPSS 19.0软件进行统计分析。3个牧草生育时期的营养品质指标和生物量、牧草体外消化率、瘤胃体外发酵参数、体外发酵总产气量和CH4产量进行单因素方差分析，采用LSD法进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同生育时期高寒草甸牧草生物量和主要营养物质

由表2可知，草地地上生物量在青草期最高(P<0.05)，草地生物量表现出随牧草返青期-青草期-枯草期先增加后下降的趋势，且在青草期地上生物量达到最高。生育时期对高寒草甸牧草主要营养物质发育规律表现出：牧草GE，CP和EE在青草期处于最高水平(P<0.05)，而DM，NDF和ADF含量在青草期最低(P<0.05)，牧草Ca和P含量在枯黄达到最高(P<0.05)。

表2 高寒草甸牧草主要营养物质的变化Table 2 Seasonal dynamics of general nutrients content of herbage in alpine meadow

2.2 不同生育时期高寒草甸牧草体外消化率

高寒草甸不同生育时期牧草各营养成分的体外消化率，在体外发酵不同时间均有一定程度的变化，但总体来说，高寒草甸牧草各营养成分在体外发酵不同时间均表现出青草期高于返青期和枯草期(表3)。青草期DMD，CPD和OMD在发酵不同时间均显著高于返青期和枯草期(P<0.05)。

表3 生育时期对高寒草甸牧草体外消化率的影响Table 3 Effects of growth stages on the vitro digestibility of alpine meadow

2.3 生育时期对高寒草甸牧草瘤胃体外发酵参数的影响

由图1可知，生育时期对高寒草甸牧草体外发酵参数影响显著(P<0.05)。高寒草甸青草期牧草在体外发酵12，24和48 h时间点的NH3-N含量显著高于枯草期(P<0.05)；青草期发酵在48 h乙酸和丙酸含量处于最高水平(P<0.05)；青草期发酵的12，24和48 h，戊酸、异戊酸和乙酸/丙酸显著高于枯草期(P<0.05)。

图1 生育时期对高寒草甸牧草体外发酵参数的影响Fig.1 Effects of growth stages on the parameters of herbage in vitro fermentation in alpine meadow注：同一发酵时间不同生育时期标注的不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同Note:Different case letters at the same fermentation time with different growth stages indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.4 生育时期对高寒草甸牧草体外发酵总产气量和CH4产量的影响

由图2可知，瘤胃体外总产气量和CH4产量随着发酵时间的推移，呈增加趋势。生育时期对高寒草甸牧草牦牛瘤胃体外不同发酵时间(6，12，24，48 h)总产气量和CH4产量均产生显著变化(P<0.05)，瘤胃体外发酵48 h总产气量和CH4产量显著处于最高水平(P<0.05)，体外发酵24 h总产气量和CH4产量显著高于发酵6，12 h总产气量和CH4产量(P<0.05)，体外发酵12 h总产气量和CH4产量显著高于发酵6 h总产气量和CH4产量(P<0.05)。3个时期牧草不同发酵时间(6，12，24，48 h)总产气量和CH4产量的变化规律为返青期>青草期>枯草期(P<0.05)。

图2 生育时期对牧草体外发酵总产气量和CH4产量的影响Fig.2 Effects of growth stages on forage total gas production and CH4 production in vitro fermentation注：同一发酵时间不同生育时期标注的不同字母表示差异显著(P<0.05)Note:Different case letters at the same fermentation time with different growth stages indicate significant difference at the 0.05 level

3 讨论

3.1 生育时期对高寒草甸牧草营养品质的影响

青藏高原因其独特的高寒低温气候特点，天然草原牧草生长发育也表现出明显的季节性变化，即“春生，夏长，秋冬枯”。4—6月初，高寒草甸牧草由萌芽期进入返青期，6—8月快速生长，随营养物质的积累出现旺盛期，自9月上旬开始，牧草开始进入枯黄期，营养物质逐渐流失，地上生物量不再增加，直至次年牧草再次返青，进入第二个生育期，周而复始。

本研究中牧草CP，EE，ADF和NDF含量存在明显的季节动态变化特征，5月份返青牧草因含有较多的立枯物而表现出CP和EE含量显著低于青草期，至9月份青草期CP和EE含量达到最大值，之后随生育期推移，从青草期至枯草期逐渐下降，在枯草期12月份降到最低值，而牧草ADF和NDF含量的季节动态变化趋势则与牧草CP和EE含量变化趋势相反，即自5月份牧草返青时开始下降，至9月份青草期，其含量呈现最低值，而后由于牧草生育时期的延迟，从青草期至枯草期逐渐升高，在枯黄期12月份出现最高值，这与前人在典型草原、荒漠草原和高寒草原的研究结果一致，发现返青期和青草期牧草DM，NDF和ADF含量较低，而CP和EE含量则与之相反，与本研究结论一致[3,22-24]。牧草的呼吸能力由气温控制，气温高则呼吸快，由于牧草可进行光合作用，光合作用在消耗非结构性碳水化合物的同时，使得牧草中DM含量得以增加，进而导致牧草中结构性碳水化合物含量增加，造成牧草CP和EE含量显著下降[3,27]。

研究发现牧草消化率表现出明显的随生育时期变化特征[25-26]。本研究中牧草营养物质消化率受到生长季节的影响比较大，总体上先升高后下降，高寒草甸返青期、青草期和枯黄期牧草DMD，CPD和OMD在体外发酵不同时间均表现出青草期显著高于返青期和枯草期，NDFD和ADFD体外发酵不同时间均表现出青草期显著低于返青期和枯草期。这与和海秀[21]在新疆沙尔套山牧草体外消化率四季变化规律一致，发现青草期牧草消化率最高。与梁建勇等[3]研究玛曲高寒牧草干物质瘤胃降解率动态变化一致，发现6—7月青草期牧草体外发酵48 h降解率最高，8—9月枯草期牧草体外发酵48 h降解率最低。与范小红等[27]的研究结果一致，DMD，OMD以及CPD的含量因牧草停止生长而减少，与此同时，牧草的NDF和ADF含量均增加，对应牧草成长时，DMD，CPD和OMD增加，而NDFD和ADFD下降。反刍动物瘤胃对鲜嫩多汁牧草的消化能力比多纤维干枯牧草的消化能力高，牧草中干物质和纤维含量决定了瘤胃消化率的高低。丁玲玲等[28-29]研究表明，土壤微生物对牧草营养物质的积累有显著的影响，而微生物的数量受到时间的影响，一般在5月份时微生物数量最多，牧草处于青草期时，营养价值最高，随着牧草生长，其营养价值因为牧草发生木质化过程而降低，证实了上述试验中，在冬季牧草枯草期时，营养价值降低的结果。

3.2 生育时期对高寒草甸牧草瘤胃发酵参数和CH4产量的影响

氮元素是家畜自身最重要的营养元素之一，在家畜体内有着非常重要的生物学功能。对家畜而言，饲粮是最主要的氮素来源，采食是最重要的获取氮素的方式之一。因此饲粮所含氮素的多少和可利用性(消化率)，决定了家畜能获得多少氮素。这也为瘤胃微生物提供氮源有着重要的意义，瘤胃可作为基体，容纳饲料中大部分蛋白质(70%)在此吸收与消化。反刍家畜的瘤胃中存在着众多的微生物载体，例如细菌等，会使蛋白质水解产生游离氨基酸等分解产物，而这些分解产物，可促进瘤胃中微生物发生变化，进一步形成微生物蛋白质[30]。而反刍家畜瘤胃中NH3-N和MCP的浓度是间接反映出瘤胃发酵状态的因素之一，Suwanlee等[31]通过分析，得到影响反应时NH3-N浓度，最合适时为0.8～56.1 mg·mL-1，在本试验中，所有组体外发酵液NH3-N浓度范围为6.84～12.67 mg·mL-1，均在最佳浓度范围内，且青草期NH3-N浓度最高，这可能是因为青草期粗蛋白含量也最高的原因导致，与张盼盼等[33]研究内蒙东苏旗不同季节牧草对瘤胃内环境的影响结果一致，NH3-N浓度随牧草生育时期延长逐渐降低，与海存秀等[21]研究青海高寒牧草营养动态结果一致，6—7月青草期NH3-N含量达到峰值，然后逐渐降低。

反刍家畜瘤胃在碳水化合物发酵过程中，会生成较多的挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)，包括乙酸、丁酸、异丁酸等，其含量占到了总VFA的95%[33]，在瘤胃发酵中扮演着及其重要的作用。反刍动物会将其采食的饲料在瘤胃内转化成有机酸、微生物蛋白和氨等营养物质，经肠道上皮吸收，为其提供能量。而有机酸中乙酸和丙酸分别是进行氧化代谢和糖异生的重要媒介,所有代谢反应[34]均有丙酸参与。本研究中，青草期有机酸含量要高于返青期和枯草期，这可能是青草期碳水化合物含量最高的原因造成的，可促进发酵快速进行，而CP含量一般在春冬季比较低，可提供氮含量少，纤维降解菌可利用氮源少[32-33]。本试验中，青草期牧草发酵48 h时，体外培养液的乙酸、丙酸和丁酸浓度显著高于返青期和枯黄期，这表明非结构性碳水化合物含量在青草期较多，牧草的使用价值提高，制造微生物蛋白质的能力提高，这与张盼盼等[32]对内蒙东苏旗不同季节牧草瘤胃内环境的影响研究结果一致，在6—8月，绵羊瘤胃中乙酸等物质的浓度都高于12月，夏秋两季差异不显著。

总产气量和CH4产量的高低反映了牧草在瘤胃中的可发酵程度和瘤胃微生物的活性强弱[35]。目前，有关生育时期对反刍家畜瘤胃发酵总产气量和CH4产量影响的相关文献报道较少。本试验中，返青期牧草在瘤胃中的可发酵程度显著高于青草期和枯草期，瘤胃微生物活性明显增强，表现为返青期牧草不同发酵时间(6，12，24，48 h)总产气量和CH4产量显著高于青草期和枯黄期，且随着牧草体外发酵时间的延长，瘤胃体外总产气量和CH4产量整体均呈现增加趋势。这可能是牧草中碳水化合物含量在青草期较高，在进行发酵时，可快速进行，而返青期和枯草期牧草CP含量低，纤维降解菌可利用氮源不足，瘤胃的发酵速度因为其对应微生物的数量以及活性的降低而减慢，进一步影响CH4以及气体总含量。刘树军[36]在其研究中表明：饲草的品质与其产生CH4的多少成反比关系，与上述试验结果一致，发酵水平高的饲草，因为产生的CH4少，可有效控制温室效应加剧，饲料的使用价值也更高。张毕阳等[37]研究指出：瘤胃产生的气体含量与自身优劣成负相关；与体内消化速度成正比，证实了造成瘤胃的发酵模式与CH4含量变化原因的相同结论。

4 结论

生育时期对高寒草甸牧草总能、粗蛋白、粗脂肪、干物质含量、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维等主要营养物质含量，牧草干物质体外消化率、粗蛋白体外消化率、有机物质体外消化率、中性洗涤纤维体外消化率和酸性洗涤纤维体外消化率，牧草瘤胃中乙酸、丁酸、异戊酸浓度、氨氮、甲烷排放量等发酵参数均有显著影响，综合考虑，青草期牧草生物量、营养品质和体外消化率最高，瘤胃发酵特性最佳，甲烷排放量最低。