王文军, 刘 磊, 朱碧锋, 王成之, 王含笑, 马云锡, 魏江文, 王森山

(甘肃农业大学植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室， 甘肃 兰州 730070)

苜蓿蚜(Aphiscraccivora)、豌豆蚜(豆无网长管蚜，Acyrthosiphonpisum)和苜蓿斑蚜(Therioaphismaculata)是危害我国苜蓿生长(MedicagosativaL.)较为严重的3种蚜虫[1-3]。豌豆蚜具有发育历期较短、世代重叠严重、体形微小、取食隐蔽等特点。大量使用化学农药难以对豌豆蚜取得理想的控制效果，而且容易引起残留(Residue)、抗性(Resistance)和再度猖獗(Resurgence)3R问题及食品安全问题[4]。豌豆蚜在国内有绿色型和红色型2种颜色的生物型[5]，绿色型在我国发现历史久远，分布较广，对它的研究也较多[6]。红色型在国内发现晚，对它的发生规律、危害机理及防治措施等缺乏研究，若一旦爆发，将容易成灾[7-8]。因此，对豌豆蚜的防治研究引起广大学者的重视。

芥子油苷(Glucosinolate biosynthesis，GS)为β-硫代葡萄糖苷N-羟硫酸盐，是存在于十字花科植物中的一类重要的次生代谢物[9]。芥子油苷与其降解产物具有多种生物学功能，如参与植物防卫反应、抑制昆虫取食[10]。李鲜等[11]研究了十字花科植物硫苷的分布、生化特性、酶促水解产物的形成和生理活性等，结果表明，硫苷酶促水解产物可以有效地预防昆虫的侵害。Kliebenstein等人研究表明，桃蚜(Myzuspersicae)取食拟南芥后，将会诱导芥子油苷的产生；且芥子油苷能抑制桃蚜对拟南芥的取食[12]。

本文将对芥子油苷对豌豆蚜生长、存活及保护酶的影响这一关键问题展开研究，通过在人工饲料中添加不同浓度芥子油苷饲喂豌豆蚜，观察芥子油苷对豌豆蚜的生长发育的影响，测定饲喂后豌豆蚜的存活率、有翅蚜率、相对日均体重增长率及保护酶活性指标等，明确芥子油苷对豌豆蚜生长发育及体内保护酶的影响，以期为芥子油苷抗豌豆蚜的生化机理提供理论依据，也为开发药用植物资源、寻找新的植物源杀虫剂理论研究与实践提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1供试植物材料 蚕豆(ViciafabaL.)播种于育苗杯(宽：5 cm，高：8 cm；基质为土壤∶草炭∶蛭石=3∶2∶1)中育苗，后置于人工气候箱中培养(温度:24℃，相对湿度:70%，光照:16 h∶8 h)。育苗50杯，每杯保苗3株，挑选生长发育一致的4叶期蚕豆植株接蚜供试。

1.1.2供试虫源 豌豆蚜由甘肃农业大学植物保护学院昆虫生态实验室提供；供试豌豆蚜在室内盆栽蚕豆上饲养，饲养条件与育苗的条件一致。挑选成虫在离体叶片饲养12 h，待产蚜后剔除成蚜，选用初产2龄若蚜，用于人工饲料饲养。

1.2 试验方法

1.2.1豌豆蚜饲养方法 不同浓度芥子油苷的人工饲料配制，参照叶超[20]和路康等[21]人的饲养方法。含芥子油苷人工饲料由磷酸三钾、矿物质、维生素、蔗糖化合物及氨基酸(天津凯信化工公司)加入不同浓度的芥子油苷(上海冠导生物工程有限公司，且芥子油苷为纯度99%的植物提取物)组成。

养虫笼以有机双通管为主体(宽:2.5 cm，高:3 cm)，一端用封口膜封住，添加配制好的饲料100 μL，然后再封一层石腊膜，另一端不封。然后在双通管内部有饲料一端接上蚜虫，待稳定取食后进行饲养。饲养过程中，养虫笼无封口膜的一端朝下，有封口膜的一端朝上，并放在SPX-300型光照培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)中饲养及观察(图1)。

图1 人工饲料饲喂装置Fig.1 Arificial diet feeding site setup

1.2.2试验设计 依据十字花科植物中芥子油苷含量为1.87 μmol·g-1[22]，本研究设置芥子油苷浓度为0 μmol·g-1(CK)，0.94 μmol·g-1(A1)，1.87 μmol·g-1(A2)和为2.86 μmol·g-1(A3)4个处理，每个处理重复3次，每个重复30头蚜虫，测定初产2龄若蚜豌豆蚜的存活率、产蚜量及相对日均体重增长率。将在豌豆蚜取食6 d，12 d和20 d测定存活率。

1.2.3不同浓度芥子油苷对豌豆蚜保护酶活性的分析 接种处理及样品采集：将不同浓度芥子油苷添加于人工饲料，豌豆蚜取食0 d(CK)，1 d，2 d和3 d，每个处理收集100头。各处理设3个重复，共取样4组。挑取的豌豆蚜经液氮处理后保存于-80℃以备酶活性测定。

[11]胡叠：《京剧的创新传统与当代立场》，《中国戏曲学院.京剧与现代中国社会——第三届京剧学国际学术研讨会论文集》，中国戏曲学院，2009年，第7页.

酶液提取：SOD，POD和CAT活性测定参考袁伟宁[23]，并略加改进。取10头豌豆蚜称重，置于预冷的试管中，加入1 mL 50 mmol·L-1pH值7.8的预冷磷酸缓冲液。在冰块上研磨成匀浆后，于高速冷冻离心机4℃，10 000 g下离心10 min，上清液即为提取酶液，用于SOD，POD，CAT活性及可溶性蛋白总量测定。

1.2.4豌豆蚜可溶性蛋白总量测定 可溶性蛋白总量测定参考BCA法蛋白含量测定试剂盒，酶标仪(BioTek Instruments，Inc)预热30 min，调到波长562 m，蒸馏水调零[24]。具体步骤如下：

a．配置BCA工作液，根据样本数量计算BCA工作液所需总量，将试剂A(试剂A：1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠和0.16%酒石酸钠等物质，混合调pH值至11.25)和试剂B(试剂B：2%硫酸铜)按照50:1的体积比配制，充分混匀，置于60℃水浴锅中预热30 min。

b．将蒸馏水空白、标准品和待测样本各4 μL分别加到做好标记的96孔板中，每个测定样本3个水平重复。

c．每孔加入200 μL BCA工作液，充分混匀，盖上板盖，60℃孵育30 min。待冷却至室温，快速完成检测。

d．用酶标仪在562 nm处，测定每个样本、标准品及空白管的吸光值，记录数据。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析。

豌豆蚜取食含芥子油苷的人工饲料后，统计豌豆蚜的存活率、相对日均体重增长率和有翅蚜率(RRGR)，统计周期为20 d。

RRGR[25]计算公式如下：

式中W1是饲养前虫体重量，W2是长至成蚜时的体重，发育历期(DD)

2 结果与分析

2.1 芥子油苷对豌豆蚜生长，存活的影响

红色型和绿色型豌豆蚜取食含有不同浓度芥子油苷人工饲料的存活率、相对日均体重增长率和有翅蚜率如表所示(表1，2)。CK的存活率均高于90%。相比CK，取食含有不同浓度的芥子油苷的人工饲料不同时间后，红色型和绿色型豌豆蚜的存活率均显著降低。取食6 d后，红色型和绿色型豌豆蚜的存活率和RRGR都随着饲料中芥子油苷浓度增大而显著降低(P<0.05)。取食6 d到12 d后，取食不同浓度人工饲料的豌豆蚜存活率在显著降低，并且A1，A2和A3与CK之间差异显著(P<0.05)。取食20 d后，除红色型A1为15.5%，其余处理都在2%左右。红色型和绿色型的RRGR随芥子油苷浓度增大而逐渐降低，其中CK均为最高，分别为0.25%和0.24%。两个色型豌豆蚜的有翅蚜率均随着饲料中芥子油苷浓度的增大而增大。但仅A3与CK之间差异显著(P<0.05)，分别为红色型46.0%、绿色型43.3%。

表1 不同浓度芥子油苷对红色型豌豆蚜生长存活的影响Table 1 Effect of different Glucosinolate on the growth and survival ment of red pea aphid

2.2 豌豆蚜可溶性蛋白总量测定

取食添加不同浓度芥子油苷的人工饲料3 d后，红色型豌豆蚜体内的可溶性蛋白总量相比CK显著升高(P<0.05)，取食1 d和2 d后，仅2.86 μmol·g-1A3的可溶性蛋白总量相比CK显著升高(P<0.05)(表3)。绿色型豌豆蚜取食添加不同浓度芥子油苷人工饲料后，体内可溶性蛋白总量升高，在第3 d时A2和A3豌豆蚜体内可溶性蛋白总量均显著升高(P<0.05)(表4)。整体上，与红色型豌豆蚜相比，绿色型豌豆蚜体内的可溶性蛋白总量更容易被芥子油苷诱导。

表3 不同浓度芥子油苷对红色型豌豆蚜可溶性蛋白总量变化的影响Table 3 Effects of different concentrations of glucosinolates on the total amount of soluble protein of pea aphid red

表4 不同浓度芥子油苷对绿色型豌豆蚜可溶性蛋白总量变化的影响Table 4 Effects of different concentrations of glucosinolates on the total amount of soluble protein of pea aphid green

2.3 不同浓度芥子油苷对豌豆蚜保护酶活性的分析

2.3.1SOD酶活性变化 豌豆蚜取食添加不同浓度芥子油苷人工饲料后，SOD酶活性变化如图2所示。图2-A表示红色型豌豆蚜取食人工饲料后SOD酶活性的变化，结果表明，随取食时间增加、芥子油苷浓度的升高，红色型蚜虫体内的SOD酶的活性逐渐升高。除0.94 μmol·g-1处理1 d外，在不同时间的处理SOD酶活均显著高于对照(P<0.05)。图2-B表示绿色型豌豆蚜取食人工饲料后SOD酶活性的变化，结果表明，随蚜虫取食时间增加、芥子油苷浓度升高，绿色型蚜虫体内的SOD酶的活性逐渐升高。取食不同浓度的芥子油苷不同时间后，绿色型豌豆蚜体内的SOD酶活性均显著高于对照(P<0.05)。整体上而言，随着人工饲料中芥子油苷浓度的升高，红色型和绿色型豌豆蚜体内的SOD酶活性均逐渐升高。与对照相比，红色型豌豆蚜取食含有芥子油苷的人工饲料后，SOD酶活性上调倍数高于相同处理的绿色型豌豆蚜。

表2 不同浓度芥子油苷对绿色型豌豆蚜生长存活的影响Table 2 Effect of different Glucosinolate on the growth and survival ment of green pea aphid

图2 不同浓度芥子油苷处理人工饲料蚜虫体内SOD活性变化Fig.2 Changes of SOD activity in artificial feed aphid treated with different concentrations of glucosinolate

2.3.2POD酶活性变化 与SOD酶活性的变化类似，随着人工饲料中芥子油苷浓度的升高，红色型和绿色型蚜虫体内的POD酶的活性均逐渐升高(图3)。红色型和绿色型豌豆蚜在取食浓度为2.86 μmol·g-1的芥子油苷不同时间后，体内的POD酶的活性上调最高。红色型豌豆蚜取食浓度为0.94 μmol·g-1和1.87 μmol·g-1的芥子油苷不同时间后，除0.94 μmol·g-1处理2 d外，其余处理的POD酶的活性显著高于对照(P<0.05)。而绿色型豌豆蚜取食浓度为0.94 μmol·g-1和1.87 μmol·g-1的芥子油苷不同时间后，POD酶活性相比对照均显著上调，且上调倍数高于相同处理的红色型豌豆蚜(P<0.05)。整体上而言，与对照相比，绿色型豌豆蚜取食含有芥子油苷的人工饲料后，POD酶活性上调倍数高于相同处理的红色型豌豆蚜。

图3 不同浓度芥子油苷处理人工饲料蚜虫体内POD活性变化Fig.3 Changes of POD activity in artificial feed aphid treated with different concentrations of glucosinolate

2.3.3CAT酶活性变化 豌豆蚜取食添加不同浓度芥子油苷人工饲料后，CAT酶活性变化如图4所示。结果显示，随着人工饲料中芥子油苷浓度的升高，红色型和绿色型豌豆蚜体内的CAT酶活性均显著高于对照(P<0.05)。且与对照相比，红色型豌豆蚜取食含有芥子油苷的人工饲料后，CAT酶活性上调倍数高于相同处理的绿色型豌豆蚜。

图4 不同浓度芥子油苷处理人工饲料蚜虫体内CAT活性变化Fig.4 Changes of CAT activity in artificial feed aphid treated with different concentrations of glucosinolate

3 讨论与结论

研究结果表明，在人工饲料中添加芥子油苷浓度为0.94 μmol·g-1，1.87 μmol·g-1和2.86 μmol·g-1，随着芥子油苷浓度的增加，豌豆蚜存活率和相对日均体重增长率受到一定的抑制，对有翅蚜率具有促进作用，这说明芥子油苷对豌豆蚜具有毒杀作用。在2.86 μmol·g-1时，不同时间内豌豆蚜的存活率和相对日均体重增长率达到最低，而有翅蚜率却达到最大。

植物产生次生代谢物质的功能主要表现在自身防御及繁衍后代2个方面，它们具有极其重要的生态学意义。唐仕娟[26]，邵娅等[27]人利用添加不同浓度齐墩果酸、单宁酸的人工饲料饲喂豌豆蚜，结果表明2种物质对豌豆蚜的生长发育及繁殖具有一定的抑制作用。陈巨莲等人将不同浓度的次生物质添加到麦蚜全纯人工饲料中，饲喂麦长管蚜(Sitobionavenae)，结果表明单宁酸和总酚等植物次生物质对麦长管蚜的生长发育有明显的抑制作用；也说明单宁酸和总酚等植物次生物质减缓了麦长管蚜的生长，使其体重逐渐下降。我们研究发现，豌豆蚜取食芥子油苷后，其存活率和相对日均体重增长率也受到一定的抑制[28-29]。张海峰研究了芥子油苷对烟粉虱(Bemisiatabaci)生长发育的影响，结果表明，芥子油苷的种类和含量都发生变化，这与烟粉虱的取食有关，烟粉虱的产卵量也出现差异，并且烟粉虱取食使芥蓝芥子油苷含量上升，说明芥子油苷参与防卫反应并起重要作用[30]。Braendle研究发现红色型豌豆蚜比绿色型豌豆蚜更容易离开寄主植物[31]，邵娅等[27]人通过含有单宁酸的人工饲料饲喂豌豆蚜，发现有翅蚜率随单宁浓度的增加，先升高然后下降。本试验通过研究，结果表明芥子油苷对豌豆蚜有翅蚜率也具有促进作用。

SOD，POD和CAT是昆虫体内抗氧化的保护酶，它们3者能互相协调一致，与体内抵御外界病虫害侵害及植物的次生物质密切相关[32-33]。本研究表明，当豌豆蚜取食不同浓度含有芥子油苷的人工饲料，随着蚜虫取食时间延长、芥子油苷的浓度升高，3种酶活性在逐渐升高。当豌豆蚜取食2.86 μmol·g-1的芥子油苷人工饲料3 d时，其体内的SOD，POD和CAT活性最高，而可溶性蛋白总量最小，说明芥子油苷对蚜虫体内酶活性有一定的促进作用。由此可见，保护酶的酶活性变化对于昆虫体内抵御有害物质起着重要的作用[34]。植食性昆虫取食含大豆胰蛋白酶的饲料后，能够调节自身的保护酶系统SOD，POD和CAT的活性作用，保护其不被受侵害[35]。朱香镇等人通过研究在人工饲料中添加棉酚和芸香苷2种植物次生物质饲喂绿盲蝽(Apolyguslucorum)后，其能影响绿盲蝽体内3种保护酶的变化，表明绿盲蝽受到不同外源次生物质或者不同浓度外源次生物质胁迫后，其体内保护酶活性将发生显著性变化，且是一个复杂的过程，不同酶的变化处于一种相互协调状态，以应对外界环境条件的变化[36]。王亚军[37]等人研究表明，苦参碱、氧化苦参碱和山奈酚这3种植物次生代谢物质对舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫体内超氧化物歧化酶具有抑制作用，可能与苦参碱、氧化苦参碱和山奈酚对舞毒蛾幼虫的杀虫作用有关。

综上所述，不同浓度的芥子油苷对豌豆蚜的生长存活有一定的抑制作用。虽然随着蚜虫取食时间延长、芥子油苷的浓度升高，超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶酶活性逐渐升高，但豌豆蚜的存活率降低。豌豆蚜体内的3种保护酶活性升高，但其在对豌豆蚜抵抗芥子油苷的过程中作用不明显。应进一步分析芥子油苷对豌豆蚜解毒酶等活性及基因表达的影响，从而揭示芥子油苷对豌豆蚜的致死机理。