张彩丽，刘湘花，李 欣，孙 宁，高鸿建

锇酸后固定是生物电镜样品制备中的关键环节。如果锇酸固定后清洗不彻底，则在乙醇脱水过程中会出现组织内的四氧化锇被还原成二氧化锇并沉淀在组织内，电镜下呈现黑色的细小颗粒(锇黑颗粒)。这种人工假象不但掩盖了组织结构的细节，而且混淆结果的判断。本实验通过对比常规方法前处理和碳化方法前处理结果，分析碳化方法前处理在避免出现锇黑颗粒方面的优势，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本 收集2017～2019年河南中医药大学中医药科学院电镜中心接收的送检实验动物标本825例，其中包括肺、肾、心、脑、肝组织，其中行常规方法前处理组600例，碳化方法前处理组225例。

1.1.2主要仪器设备 日本电子JEM-1400生物透射电镜、徕卡全自动树脂处理机(LeicaEMTP)、徕卡全自动超薄切片机(LeicaEMUC7)戴通钻石刀、琅玕智能电热恒温培养箱(DHP-9050B)、超纯水机(Milli-Q)、离心机(长沙湘智TGL16)、碳化船舱(自制)。

1.1.3试剂 (1)812环氧树脂；(2)丙酮；(3)梯度乙醇；(4)0.1 mol/L PBS(pH 7.2)；(5)1%锇酸水溶液；(6)醋酸双氧铀染液；(7)柠檬酸铅染液。

1.2 方法

1.2.1组织树脂块制备 组织送检时已用2.5%戊二醛固定4～24 h，按前处理流程分为常规方法前处理和碳化方法前处理。(1)常规方法前处理流程。①PBS漂洗：15 min×4次；②后固定：1%锇酸内浸泡固定1.5 h；③PBS漂洗：15 min×4次；④梯度乙醇脱水：50%→70%→80%→90%乙醇各15 min→100%乙醇15 min×2次→100%丙酮15 min×2次；⑤浸透：1 ∶1→2 ∶1树脂丙酮各2 h；⑥包埋：硅胶板内纯环氧树脂包埋；⑦聚合：37 ℃ 12 h→45 ℃ 12 h→60 ℃ 24 h。(2)碳化方法前处理流程：操作步骤引自“生物电镜样品碳化方法”(中国专利CN201410183132.2)[1]，具体操作由专利发明人高鸿建老师指导。

1.2.2超薄切片与铅铀双染色 用电动砂轮打磨掉组织周边多余树脂后在显微镜下用刀片将组织头修切成锥形，然后在超薄切片机上切出70 nm厚的薄片，铜网捞片，晾干；……