韩利方，邹均平，谢月华，刘易扬，闫文朝

（1河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023；2广西贺州市八步区农业农村局动物卫生监督所，广西贺州 542899）

0 引言

寄生虫病危害动物和人类的健康，大部分寄生虫感染宿主后可通过宿主粪便排出虫卵、或卵囊、或包囊等病原体，准确、有效地检测出这些病原体能为动物和人的寄生虫病防控提供重要的科学指导[1-3]。

粪便检查方法中，直接涂片法、水洗沉淀法和饱和盐水漂浮法等为定性检测方法，不能准确定量检测[4]。经典麦克马斯特虫卵计数板法(McMaster egg counting method)是最常用的寄生虫虫卵计数方法之一，能够对粪便中虫卵进行定性和定量检测[2-4]。经典麦克马斯特虫卵计数板由于其计数室的底部表面没有固定面积的刻度线，只能利用饱和盐水将比重较轻的线虫和绦虫虫卵、球虫卵囊漂浮到计数室的顶部表面，和顶部固定面积的刻度线在同一个视野，进而实现虫卵计数，但是不能对比重较重的吸虫和棘头虫虫卵、原虫包囊进行计数[5-7]。

鉴于经典麦克马斯特虫卵计数板设计上存在的不足[8-10]，本实验室对经典麦克马斯特虫卵计数板进行改进设计，并研制出一款改进型麦克马斯特虫卵计数板，利用饱和盐水、自来水或生理盐水可实现对吸虫、绦虫、线虫和棘头虫虫卵、球虫卵囊、原虫包囊的计数。本研究将利用改进型麦克马斯特虫卵计数板通过漂浮法和沉淀法对不同样品进行虫卵计数和分析，评价改进型麦克马斯特虫卵计数板的应用效果，以期为临床和实验室样品中虫卵定量分析提供更便捷有效的检测工具。

1 材料与方法

1.1 虫卵计数板

改进型麦克马斯特虫卵计数板为河南科技大学动物科技学院寄生虫学实验室的授权专利产品（专利号：ZL201820602559.5），该改进型麦克马斯特虫卵计数板是基于经典麦克马斯特虫卵计数板进行改进设计和研制的升级产品。通过独特设计，改进型麦克马斯特虫卵计数板的计数室上、下壁均有1 cm2的正方形刻度，每个1 cm2的正方形被均分为64个小方格（如图1），使其既可以通过漂浮法对比重较轻的线虫和绦虫虫卵、球虫卵囊进行计数，又可以通过沉淀法对比重较重的吸虫、棘头虫虫卵和原虫包囊进行计数。

图1 改进型麦克马斯特虫卵计数板结构示意图（单位：mm）

经典麦克马斯特虫卵计数板（上海润友科技有限公司制造），是基于漂浮法对样品中线虫和绦虫虫卵、球虫卵囊进行计数，作为本实验的参考标准方法[10-11]。

1.2 样品

45日龄断奶幼兔的、镜检球虫卵囊阳性的新鲜粪便样品，用于评价改进型麦克马斯特虫卵计数板基于沉淀法的定量检测效果；经产母兔的、镜检球虫卵囊阳性的新鲜粪便样品，用于评价改进型麦克马斯特虫卵计数板基于漂浮法的定量分析效果[10,12]。

用2.5%重铬酸钾溶液保存的柔嫩艾美耳球虫卵囊悬液，于4℃冰箱保存，用于评价改进型麦克马斯特虫卵计数板对液体悬液样品的计数效果。

1.3 对固体粪便样品中球虫卵囊的计数

1.3.1 基于漂浮法对固体粪便样品中球虫卵囊的计数参考有关方法[2]，用经典麦克马斯特虫卵计数板对2 g母兔粪样进行球虫卵囊计数3次，根据相关公式计算每克粪便卵囊数量，即OPG值。然后用改进型麦克马斯特虫卵计数板分别对2、3、4、5、6、7 g母兔粪样进行球虫卵囊计数3次。具体操作为：称取(m)g粪样，分次加入共(60-m)mL饱和氯化钠溶液（400 g食盐+1 L自来水，煮沸溶解放置室温有盐结晶析出即得），用玻璃棒捣碎混匀，100目筛网过滤，将滤液快速注满改进型麦克马斯特虫卵计数板的计数室，在显微镜载物台上静置5 min，移动视野用手动计数器查完64个方格内卵囊的数量N，最后根据公式(1)计算各组的OPG值：

通过与经典麦克马斯特虫卵计数板的计数结果比较，筛选改进型麦克马斯特虫卵计数板基于漂浮法合适的粪样克数，并评价其准确度。

1.3.2 基于沉淀法对固体粪便样品中球虫卵囊的计数 用经典麦克马斯特虫卵计数板对2 g断奶幼兔粪样进行球虫卵囊计数3次，根据相关公式计算OPG值[4]。然后用改进型麦克马斯特虫卵计数板分别对0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g断奶幼兔粪样进行球虫卵囊计数3次，不同质量的粪便样品用自来水稀释混匀，其他操作同1.3.1部分，最后计算得到各组的OPG值。通过与经典麦克马斯特虫卵计数板的计数结果比较，筛选改进型麦克马斯特虫卵计数板基于沉淀法合适的粪样克数，并评价其准确度。

1.4 对液体悬液样品中球虫卵囊的计数

用饱和氯化钠溶液将柔嫩艾美耳球虫卵囊悬液10倍稀释后，注入改进型麦克马斯特虫卵计数板的计数室内，静置5 min待卵囊上浮后，在10倍物镜将视野调至计数室上壁表面并计数，分别查完64个方格内的卵囊总数为A1，最后根据公式(2)[2]计算每毫升卵囊悬液中卵囊的数量：

用自来水将柔嫩艾美耳球虫卵囊悬液10倍稀释后，注入改进型麦克马斯特虫卵计数板的计数室内，静置5 min沉淀后，在10倍物镜将视野调至计数室下壁表面并计数，分别查完64个方格内的卵囊总数为A2，最后根据公式(3)计算每毫升卵囊悬液中卵囊的数量

上述两种方法各重复计数3次。将基于漂浮法和沉淀法计数得到的结果与经典麦克马斯特虫卵计数板计数结果进行比较分析，评价改进型麦克马斯特虫卵计数板对液体悬浮样品中球虫卵囊计数结果的准确性。

1.5 数据处理与统计分析

用EXCEL软件对各组数据进行整理，用IBM SPSS Statistics 23软件中成对样品t检验方法对各组间OPG值和卵囊密度进行统计分析，显著性水平为0.05[10]。

2 结果与分析

2.1 固体粪便样品中球虫卵囊计数效果评价

基于漂浮法的计数结果显示，改进型麦克马斯特虫卵计数板计数2 g粪便的OPG值与A组经典麦克马斯特虫卵计数板的计数结果差异不显著(P>0.05)，二者符合率高达99.49%。改进型麦克马斯特虫卵计数板计数3～5 g粪便的OPG值与经典麦克马斯特虫卵计数板的计数结果差异也不显著(P>0.05)，与A组符合率为95.59%～96.41%（如表1）。然而，当粪便样品重量大于5 g后，显微镜视野下浑浊度明显增大，杂质也变多，计数得到的OPG值明显偏小(P<0.05)（如表1）。说明改进型麦克马斯特虫卵计数板用漂浮法对2～5 g粪便样品的计数结果是准确的。

表1 基于漂浮法固体粪便样品中球虫卵囊计数结果

基于沉淀法的计数结果显示，改进型麦克马斯特虫卵计数板计数0.3～0.5 g粪便的OPG值与a组经典麦克马斯特虫卵计数板的计数结果差异不显著(P>0.05)，与a组符合率为96.48%～98.23%（如表2）。然而，当粪便重量为0.1 g时，改进型麦克马斯特虫卵计数板计数得到的OPG值明显偏大；当粪便样品重量大于0.5 g时，视野中杂质增多，浑浊度增大，干扰对卵囊的识别，明显影响计数的准确度，甚至无法计数（如表2）。说明改进型麦克马斯特虫卵计数板用沉淀法对0.3～0.5 g粪便样品的计数结果是准确的。

表2 基于沉淀法固体粪便样品中球虫卵囊计数结果

2.2 液体悬液样品中球虫卵囊计数效果评价

用饱和氯化钠溶液作为悬浮液的计数结果显示，改进型麦克马斯特虫卵计数板计数得到的每毫升悬液中卵囊数量与1组经典麦克马斯特虫卵计数板的结果差异不显著(P>0.05)，与1组的符合率为97.10%（如表3）。相对于饱和氯化钠溶液，当用自来水作为悬浮液计数时，视野中存在杂质，但不影响对卵囊的识别，计数得到的每毫升悬液中卵囊数量与1组经典麦克马斯特虫卵计数板的结果差异也不显著(P>0.05)，与1组的符合率为96.83%（如表3）。说明不论是饱和氯化钠溶液还是自来水，改进型麦克马斯特虫卵计数板对液体悬液样品中球虫卵囊计数结果均是准确的。

表3 液体悬液样品中球虫卵囊计数结果

3 讨论

3.1 相对于已有虫卵计数方法，改进型麦克马斯特虫卵计数板的优点

虫卵计数方法主要有斯陶尔虫卵计数法(Stoll egg counting method)[3,13]、改良加藤厚涂片法(Kato-Katz egg counting method)[14-15]、麦克马斯特虫卵计数板法(McMaster egg counting method)[16-18]和有限稀释法(Limiting dilution method)[19]等方法，其中前两种方法只用于临床粪便中虫卵的计数[2,15]，后两种方法既可用于临床粪便样品也可用于实验室液体悬液样品中虫卵的计数[18-20]。斯陶尔虫卵计数法、改良加藤厚涂片法和有限稀释法由于存在需要不易购买到的特殊器材，或操作比较繁琐，或杂质较多干扰计数结果等不足，影响或限制了这些计数方法的推广和应用[14,17,19]。麦克马斯特虫卵计数法是最常用的寄生虫粪便定量计数方法之一，被世界兽医寄生虫学协会推荐为反刍动物抗蠕虫药物疗效和耐药性研究的标准评价方法[21-23]，中国也将该方法列为动物球虫病标准诊断技术之一[11]。但是经典麦克马斯特虫卵计数板存在构造设计上的局限，导致其只能定量计数比重较轻的线虫、绦虫虫卵和球虫卵囊，对比重较重的吸虫、棘头虫虫卵和原虫包囊却无能为力[24-25]。

鉴于现有虫卵计数方法存在的问题[10,26-27]，本实验室基于经典麦克马斯特虫卵计数板进行结构改进，设计研制出一款改进型麦克马斯特虫卵计数板，弥补经典麦克马斯特虫卵计数板的不足。改进型麦克马斯特虫卵计数板有左右两个计数室，每个计数室底部和顶部的玻璃表面上均有1 cm2的正方形刻度区，每个1 cm2的正方形被均分为64个小方格，计数室的高度为1.5 mm，液体充满计数室后，刻度区对应的液体体积为0.15 mL。通过这种设计和试验条件优化，使该改进型麦克马斯特虫卵计数板既可以用饱和氯化钠溶液等漂浮液对粪便样品和液体悬液样品中比重较轻的虫卵进行定量计数，也可以用自来水或生理盐水对粪便样品和液体悬液样品中比重较重的虫卵进行定量计数。

3.2 基于漂浮法，改进型麦克马斯特虫卵计数板能对固体粪便和悬液样品中虫卵和卵囊进行准确计数

饱和氯化钠溶液作为漂浮液，经典麦克马斯特虫卵计数板和改进型麦克马斯特虫卵计数板利用漂浮原理对固体粪便样品和液体卵囊悬液中球虫卵囊均可进行准确计数,粪便重量影响虫卵计数的准确性[28-29]。改进型麦克马斯特虫卵计数板检测固体粪便样品时,超过5 g粪便滤液浑浊度明显增大，显微镜视野下杂质增多，干扰对卵囊或虫卵的识别，导致计数结果偏低；低于2 g时，其检测的敏感度下降，若检测感染强度较低的样品时有可能出现假阴性结果。因此，选取适量的粪便重量对虫卵计数板检测结果至关重要，适宜重量为2～5 g，这与相关报道一致[10,30]。当用改进型麦克马斯特虫卵计数板对液体卵囊悬液中球虫卵囊进行计数时，如果计数视野中卵囊过多（每小格超过20个），可以考虑用自来水对原卵囊悬液进行合适倍数稀释后，再用饱和氯化钠溶液进行稀释、计数，得到的计数结果更准确可靠[29]。本研究用的饱和氯化钠溶液作为漂浮液进行计数，漂浮液可以扩展到饱和硫酸锌、硫代硫酸钠、氯化钙等其他溶液，用虫卵计数板对粪便等样品中虫卵和球虫卵囊进行检测和计数[2,23]。

3.3 基于沉淀法，改进型麦克马斯特虫卵计数板能对固体粪便和悬液样品中虫卵和卵囊进行准确计数

自来水作为悬浮液，经典麦克马斯特虫卵计数板无法对固体粪便样品和液体悬液样品中球虫卵囊进行计数[3,10]，改进型麦克马斯特虫卵计数板却可以实现对上述两类样品中球虫卵囊进行准确检测和计数。当用改进型麦克马斯特虫卵计数板对固体粪便中球虫卵囊进行计数时，需要控制好粪便重量在0.3～0.5 g，如果粪样高于0.5 g，粪便中过多杂质沉淀到计数室底部，会遮挡部分虫卵或卵囊，同时滤液浑浊度增大，影响对虫卵或卵囊的识别，导致计数结果偏低；如果粪样太少，低于0.3 g时，会降低检测的敏感度，导致计数结果误差较大。相对漂浮法，由于该方法准确计数所用粪便样品较少，因此该方法适合感染强度较大的样品。另外，分离收集的球虫卵囊悬液中杂质相对较少，用该方法计数时，虽然视野中也有少量杂质，但是悬浮液浑浊度较低，不影响对球虫卵囊的识别和计数结果的准确性。沉淀法所用悬浮液由自来水可以扩展到生理盐水，利用改进型麦克马斯特虫卵计数板实现对粪便样品和液体悬液中所有蠕虫虫卵（包括比重较大的吸虫和棘头虫虫卵）、球虫卵囊和体积较大的原虫包囊进行检测和准确计数，操作简便、快捷[2,30]。

4 结论

本研究对一项授权专利产品—改进型麦克马斯特虫卵计数板的应用效果进行评价研究发现，该改进型麦克马斯特虫卵计数板利用饱和氯化钠溶液或自来水均可实现对固体粪便样品和液体卵囊悬液样品中球虫卵囊进行准确检测和计数，比经典麦克马斯特虫卵计数板功能更强大，为临床寄生虫病诊断和寄生虫学研究提供更有效、更简便快捷的工具。