刘亚群 王布 孔文杰 张秀珑 张志华

(河北北方学院 1附属第一医院呼吸与危重症医学科，河北 张家口 075000；2研究生部)

肺癌是严重危害人类生命健康的疾病，据世界卫生组织(WHO)2018年公布的资料显示，肺癌是世界上最常见和最致命的恶性肿瘤之一，仅2018年一年就新增1 810万病例，死亡人数高达960万，5年生存率仅为15.8%,其中非小细胞肺癌(NSCLC)患者约占所有肺癌总数的80%，超过50%的肺癌患者被诊断出NSCLC有远处转移，整体预后差，约2/3的患者确诊时已无手术机会〔1〕。要改善肺癌患者生存率，需要依靠规范有序的诊断、分期及根据其临床行为制订多学科治疗方案。随着科学的不断进步和人类的探索发现：微小RNA(miRNA)是一种内源性小分子单链RNA，由19～24个核苷酸组成〔2〕。研究人员发现miR-320a在肺癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤的发病关系密切〔3〕。关于miR-320a与血管内皮生长因子(VEGF)与肺癌发病关系，目前相关研究文献较少。本研究旨在探讨肺癌患者血清中miR-320a与VEGF的表达关系及其临床意义。

1 资料与方法

1.1标本收集 2017年9月至2019年6月河北北方学院附属第一医院入院患者中通过胸腔镜活检、电子支气管镜、肺穿刺活检确诊肺癌患者93例，纳入标准：①符合国际肺癌研究协会制定的肺癌临床诊断；②预计生存期>3个月，体能状态评分标准(ECOG-PS)评分为0～2分；③经病理学或细胞学确诊，且经CT检查证实至少存在1处可测量病灶；④心肝肾等重要脏器功能无重大损伤，功能基本正常，无严重感染；⑤骨髓储备正常；排除标准：①预计生存期<3个月；②心肝肾等重要脏器功能存在严重障碍者，合并未控制的严重感染；③未找到可供测量的或评价的实体瘤；④骨髓造血功能异常；年龄46～78岁，并于同期收集93例健康体检者设为正常健康组。本实验研究均经过患者知情同意及医院伦理委员会批准。

1.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清miR-320a表达量 入院病人于清晨6点空腹抽取静脉血4 ml，所取标本立即于离心机以3 500 r/min离心5 min，分离上层血浆并保存于-80℃冰箱。按cDNA合成试剂盒(购自北京天根生化科技公司)进行反转录。反应条件:42℃ 60 min;95℃ 3 min;产物cDNA置于-20℃冰箱保存。以cel-miR-39为外参。miR-320a的逆转录引物的正向引物(5′-3′)为 TATTCGCACTGGATACGACTCCAGC，反向引物 (5′-3′) 为 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG。外参引物购自天根生化(目录号：CD200-01)。每组各取200 μl血清，采用天根DP501柱提法提取血清中小于200 nt RNA，TGem微量分光光度计测量RNA的纯度和浓度。采用定量PCR试剂盒FP411进行Real-time PCR 反应，反应条件:95 ℃ 15 min,94℃ 20 s，65℃ 30 s，72℃ 34 s，5个循环；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算 miR-320a相对表达量。

1.3血清中VEGF检测 入院病人于清晨6点空腹抽取静脉血4 ml，所取标本立即于离心机以3 500 r/min离心5 min，分离上层血浆并保存于-80℃冰箱。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中VEGF，其中VEGF检测试剂盒购自深圳欣博盛生物科技有限公司；使用由美国Molecular Devices生产的酶标仪进行检测，在酶标仪波长为450 nm处测定OD值，并应用软件绘制标准曲线对应的浓度值，测定方法严格按照人VEGF ELISA试剂盒说明书规范操作。

1.4统计学方法 采用SPSS23.0软件进行t检验、方差分析、Pearson相关分析，采用受试者工作特征曲线面积(AUC)评估血清miR-320a、VEGF对肺癌诊断的灵敏度及特异度。

2 结 果

2.1两组血清中miR-320a与VEGF表达 肺癌组血清中miR-320a表达浓度显著低于正常健康组。VEGF肺癌血清中表达显著高于正常健康组(P<0.05)，见表1。

表1 肺癌组和正常组血清miR-320a、VEGF浓度

2.2肺癌患者血清中miR-320a、VEGF表达与患者临床病理特征关系 肺癌患者血清中miR-320a、VEGF的表达与TNM分期、分化程度、有无淋巴结转移、癌胚抗原(CEA)高低均有关(P均<0.05)。肺癌患者血清中miR-320a、VEGF的表达与患者性别、肿瘤病理类型、年龄无关(P>0.05)。见表2。

表2 肺癌患者血清中miR-320a表达、VEGF水平与患者临床病理学特征的关系

2.3肺癌患者血清中miR-320a与VEGF相关性 肺癌患者血清中miR-320a与VEGF呈显著负相关(r=-0.753，P<0.05)。

2.4血清中miR-320a、VEGF对肺癌患者的诊断价值评价 根据肺癌患者血清中miR-320a、VEGF的表达含量绘制ROC曲线(图1)，并确定miR-320a、VEGF的诊断界值分别为miR-320a=1.63、VEGF=233.88 pg/ml，为诊断界值。血清miR-320a、VEGF联合检测对肺癌的诊断价值最高，AUC为0.969(95%CI：0.948～0.991)，灵敏度、特异度分别为0.903、0.946。见表3。

图1 血清中miR-320a、VEGF诊断肺癌的ROC曲线

表3 miR-320a与VEGF对肺癌的诊断价值

3 讨 论

mirRNA是一种内源性小分子单链RNA，由19～24个核苷酸构成的。随着人类的不断探索，人类对miRNA的探索取得阶段性成果，人类发现miRNA在多种恶性肿瘤中高度表达，对肿瘤的浸润、转移、侵袭力都有不同程度的影响，其次miRNA对生存及预后及生存期都有巨大的影响〔4〕。miR-320a是miRNA家族中重要的成员之一，参与多种肿瘤的表达。miR-320a通过调节不同的信号通路在肿瘤中的表达，如磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、Wnt、信号转导子和转录激活子(STAT)3、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，从而发挥促癌或者抑癌的作用〔5〕。有研究报道miR-320a在肿瘤中(如肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌)表达水平升高或者降低而发挥癌基因的作用〔6〕。本研究提示miR-320a可能参与了肿瘤的浸润、转移以及侵袭，对肺癌的诊断及治疗有一定的指导意义。

VEGF又称为血管通透因子，是一系列参与信号传导的糖蛋白，在体外可促进血管内皮细胞的生长，在体内可诱导血管增生,其通过增加血管通透性，使血管内纤维蛋白原等血浆蛋白外渗，纤维蛋白原与血管外渗纤维连接蛋白等多种成分凝结形成交叉的纤维蛋白凝胶体，为内皮细胞、成纤维细胞的迁移提供一个纤维网络，有利于血管生成〔7〕。其次VEGF及其受体在肿瘤组织中的高水平表达与多种肿瘤的预后不良有关,这些肿瘤包括星形胶质细胞瘤、肺癌、结肠癌、膀胱癌、头颈鳞癌、肝癌等〔8〕。肿瘤血管是肿瘤生长和浸润、转移的形态学基础，其不仅向肿瘤组织提供丰富的营养，也向肿瘤宿主输出大量肿瘤细胞，导致肿瘤的扩散和转移〔9〕。本研究结果表明VEGF是肺癌较好的肿瘤标志物，对肺癌诊断及治疗有一定的指导意义。

本研究提示miR-320a与VEGF可能存在负反馈作用，同过共同的传导通路发挥协同作用，促进血管生成，并加速肿瘤的浸润、侵袭及转移〔10〕。

本研究结果表明通过联合检测可在很大程度上降低误诊率和漏诊率，对肺癌患者早期诊断提供重要的参考价值。

综上，miR-320a与VEGF的联合检测有望从理论走向临床应用，为肿瘤的病情判断、早期诊断、治疗开辟一条新的途径〔11〕。