汪艳平，韦正，张鹏，蓝建京，陈海林，韦飞燕，张晖英

（河池学院 化学与生物工程学院，广西河池 546300）

山豆根是豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根茎，又名苦豆根、广豆根、小黄连、三小叶山豆根、胡豆莲和柔枝槐等。2015版《中国药典》记载，作为一味传统的中药材，山豆根具有清热解毒、消肿利咽、泄火滋润等功效[1]，主治口燥咽干、舌红苔黄、咽喉肿痛、牙龈肿痛、肺热咳嗽以及便秘尿黄等诸多临床病症[2]。现代药理研究表明，山豆根的黄酮类和生物碱类成分在抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎及提高免疫力方面都有功效[3-6]。山豆根主要含有苦参碱、氧化苦参碱、金雀花碱和甲基金雀花碱等生物碱[7-8]，高丽槐素、三叶豆紫檀苷、山豆根色满二氢黄酮、槲皮素、芦丁等黄酮类[9]，羽扇豆醇、槐花二醇等三萜类和小分子酚及其他化学成分[10]。随着社会对传统中医药关注度的提升，筛选山豆根活性成分的最佳提取工艺在医药领域和工业生产方面均具有重要意义。本实验利用信息熵来计算各个指标的权重，为中药材提取的综合评价提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

山豆根药材，购自广西河池市宜州区药材市场，经河池学院化学与生物工程学院邓晰朝副教授鉴定为豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根茎。

苦参碱对照品（批号MUST-18040911，质量分数98.00%）、氧化苦参碱对照品（批号MUST-18041310，质量分数98.00%）、金雀花碱对照品（批号MUST-18031516，质量分数98.00%）、三叶豆紫檀苷对照品（批号MUST-17060508，质量分数98.00%）、高丽槐素对照品（批号MUST-17060512，质量分数99.99%），均购自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产；乙酸铵，二氯甲烷为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产；纯水和超纯水均由Fusion超纯水一体机制备。

WKH-1.7-A 热风循环烘箱，青州市精诚医药装备制造有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；KQ-500DE 数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；ME204E 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Fusion超纯水一体机，瑞泰纯水有限公司；DE-400g 高速多功能粉碎机，浙江红景天工贸有限公司；LC-20A 高效液相色谱仪，配置SIL-20AC 自动进样器、DGU-20A5R 脱气机、LC-20AT 四元泵、CTO-20AC 柱温箱、SPD-M20A 光电二极管阵列紫外可见光检测器，日本京都株式会社岛津制作所。

1.2 试验方法

1.2.1 供试品的制备

山豆根剔除多余的杂物和叶片，切成小块后放入烘箱中在60 ℃条件烘干，用粉碎机粉碎，过50 目标准筛，备用。精密称取0.5 g 山豆根粉末于锥形瓶中，加入一定体积和浓度的二氯甲烷-40%氨水混合液，密塞，称定质量，于超声波提取器中，按设定的提取功率、提取时间进行试验，试验结束后称定重量，补重摇匀，抽滤，滤液置入蒸发皿，通风挥干，将适量分析纯甲醇加到残渣中溶解，用10 mL 容量瓶稀释至刻度并摇匀，用规格为0.45 μm 的微孔滤膜取得供试品溶液，滤液置于样品瓶中，备用。

1.2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取金雀花碱、氧化苦参碱、苦参碱、三叶豆紫檀苷及高丽槐素对照品（干燥至恒重）2.40 mg、6.00 mg、2.30 mg、2.30 mg 和2.90 mg，置于25 mL 容量瓶中，加入纯甲醇，稀释至刻度并摇匀，制得金雀花碱（0.096 mg/mL）、氧化苦参碱（0.240 mg/mL）、苦参碱（0.092 mg/mL）、三叶豆紫檀苷（0.092 mg/mL）和高丽槐素（0.116 mg/mL）的混合标准品溶液。

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱为AQ-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈（A）-0.01 mol/L 醋酸铵溶液（B）为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为：0 ～15 min，10%A；25 min，15%A；35 min，35%A；45 min，50%A；55 min，55%A；70 min，55%A。流速为0.8 mL/min，进样量10 μL，检测波长225 nm，柱温30 ℃。

1.2.4 线性关系考察

精密量取“1.2.2”项下配制的金雀花碱、三叶豆紫檀苷、苦参碱、高丽槐素、氧化苦参碱混合对照品溶液，按照2 μL、5 μL、8 μL、10 μL 和15 μL的条件注入高效液相色谱仪，以“1.2.3”色谱条件测定其峰面积。

1.2.5 精密度考察

精密吸取“1.2.2”混合对照品溶液，按“1.2.3”项色谱条件连续进样6 次，测定5 个色谱峰的峰面积，并计算峰面积的RSD值。

1.2.6 重复性考察

精密称取6 份“2.7”项正交试验1 制备的样品，按照“1.2.1”项下方法制备成供试品溶液，按照“1.2.3”项色谱条件分别进样分析，测定其峰面积，计算5 个色谱峰的RSD值。

1.2.7 稳定性考察

取“1.2.6”项重复性试验1 号供试品溶液，于室温放置0 h、2 h、4 h、6 h、12 h 和24 h，按“1.2.3”项色谱条件进样分析，测定5 个峰的峰面积，计算5个色谱峰的RSD值。

1.2.8 加样回收率试验

精密量取6 份已知浓度的供试品5 mL，按“2.7”项下正交试验1 制备，置于25 mL 容量瓶中，分别按供试品溶液成分含量的100%加入混合对照品溶液5 mL，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，以“1.2.3”项下色谱条件测定。

1.2.9 含量测定

按“1.2.1”制备供试品溶液，按“1.2.3”项色谱条件进样分析，对金雀花碱、氧化苦参碱、苦参碱、三叶豆紫檀苷和高丽槐素5 个色谱峰进行分析。

1.2.10 正交试验设计

通过预实验单因素考察结果，确定以二氯甲烷-40%氨水体积比、料液比、提取功率、提取时间4个考察因素，每个因素各取3 个水平（见表1），以金雀花碱、氧化苦参碱、苦参碱、三叶豆紫檀苷、高丽槐素提取率为评价指标，采用L9（34）4 因素3 水平正交实验设计对山豆根有效活性成分的提取条件进行优化。

表1 正交设计因素与水平

2 结果与分析

2.1 高效液相指纹图谱

山豆根供试液按照“1.2.3”条件进样分析，金雀花碱、氧化苦参碱、苦参碱、三叶豆紫檀苷、高丽槐素色谱峰分离度好，各峰之间分离度大于1.5，色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液（A）与供试品溶液（B）的HPLC 图

2.2 线性关系考察

以对照混合液各单体浓度为横坐标X，峰面积值A为纵坐标Y绘制标准工作曲线，得到回归方程和相关系数，见表2。

表2 混合液各单体的回归方程和相关系数

2.3 精密度考察

5 个指标成分精密度考察，峰面积RSD值为1.25%～1.98%，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性考察

5 个指标成分重复性考察，峰面积RSD值为1.45%～2.05%，表明方法重复性良好。

2.5 稳定性考察

5 个指标成分稳定性考察峰面积RSD值为1.43%～2.18%，表明样品稳定性良好，供试品溶液24 h 内稳定。

2.6 加样回收率试验

金雀花碱平均加样回收率为99.82%，RSD值为1.63%；氧化苦参碱平均加样回收率为98.78%，RSD值为2.15%；苦参碱平均加样回收率为99.56%，RSD值为1.87%；三叶豆紫檀苷平均加样回收率为99.34%，RSD值为1.93%；高丽槐素平均加样回收率为99.23%，RSD值为2.18%。

2.7 正交试验

2.7.1 正交试验结果

根据线性回归方程计算各正交试验所得的样本5 个指标性成分的含量，计算各指标成分的提取量，试验结果见表3。

表3 正交实验方案与结果

2.7.2 基于信息熵赋权的正交试验分析

计算各个指标的信息熵（Hi）：Hi=[0.976 0.977 0.899 0.960 0.991]。

计算第i项指标的系数（Wi）：Wi=[0.122 0.117 0.513 0.203 0.046]。

综合评价指标Mm＝P1m×W1＋P2m×W2＋P3m×W3+P4m×W4+P5m×W5，即金雀花碱、氧化苦参碱、苦参碱、三叶豆紫檀苷和高丽槐素各指标的权重系数依次为0.122、0.117、0.513、0.203 和0.046。

经过对山豆根的指标含量的计算，按照公式和步骤，建立以金雀花碱、氧化苦参碱、苦参碱、三叶豆紫檀苷和高丽槐素为原始评价指标矩阵，原始评价矩阵（X）为：

计算Pij，将初始矩阵转化为“概率”矩阵（P）：

2.7.3 正交试验方差分析

通过引入信息熵加权法处理分析正交试验数据，总结得出影响山豆根有效活性成分得率的因素大小顺序为D ＞B ＞C ＞A，对山豆根提取影响最大的是料液比，提取功率的影响最小。经过综合分析可知，最优提取条件为A2B3C1D1，即二氯甲烷-40%氨水体积比25 ∶1.5，料液比1 ∶40，提取功率是90 W，提取时间是20 min 。

表4 方差分析

2.8 验证实验

根据以上实验结果，按照最佳工艺条件提取山豆根有效活性成分，平行5 份进行验证试验，测得提 取物中各指标成分含量，该结果与正交试验结果基本一致，说明此工艺稳定可靠。

3 结论

本实验研究通过以二氯甲烷-氨水混合液为提取剂，以金雀花碱、氧化苦参碱、苦参碱、三叶豆紫檀苷和高丽槐素提取率作为指标考察，以正交试验设计方法研究超声波提取法提取山豆根有效活性成分的工艺条件，筛选出最佳的提取工艺条件。得出影响超声波提取的主次为料液比＞二氯甲烷∶40%氨水体积比＞提取时间＞提取功率。综合考虑5 个指标的含量及其提取率的评价，优选出的最佳提取工艺为二氯甲烷-40%氨水体积比25 ∶1.5，料液比1 ∶40，提取功率90 W，提取时间20 min。方法学考察表明，该提取工艺参数真实可靠，适合山豆根有效活性成分的提取[11]。

山豆根是一种较为常见的传统中药材，属于我国三级濒危保护植物，一般在秋季采挖。山豆根主要用于治疗咽喉肿痛、口舌生疮、湿热黄疸、蚊虫咬伤所致红肿热痛等病症。本实验以信息熵赋权法计算金雀花碱、氧化苦参碱、苦参碱、三叶豆紫檀苷和高丽槐素的权重系数，科学处理各指标对工艺影响的权重，从而使山豆根指标成分获得较高的提取率。