周 婷，岳彩鹏，黄进勇，华营鹏

(郑州大学 农学院，河南 郑州 450001)

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为冬油菜品种湘油15，由湖南农业大学官春云院士提供。

1.2 试验方法

1.2.1 甘蓝型油菜AMT家族基因的鉴定 利用拟南芥AMT氨基酸序列为种子序列进行Blast分析，在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜等植物中寻找AMT基因。在本研究中，使用了以下数据库：拟南芥信息资源数据库(TAIR)(https：//www.arabidopsis.org/)用于拟南芥氨基酸序列查找，芸薹属数据库(BRAD)v.1.1(http：//brassicadb.org/brad/)[32]用于白菜、甘蓝以及甘蓝型油菜氨基酸序列搜索。根据以下标准对芸薹属植物中的基因进行了命名：种名+染色体+同源基因的名称。例如，BnaA1.AMT1；4是指甘蓝型油菜A1染色体上拟南芥AMT1；4的同源基因。

1.2.2 AMT蛋白的分子特性鉴定 使用ExPASy ProtoParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)[33]计算了各AMT蛋白的氨基酸数目和组成、分子质量(MW)、理论等电点(pI)、平均亲水系数(GRAVY)和不稳定性指数。利用THMMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和TMpred(https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)[34]预测氨基酸序列的跨膜结构域(TM)数目。

1.2.3 AMT家族基因进化树的构建 利用MEGA 7中的ClustalW功能，对20个甘蓝型油菜AMT蛋白序列、6个拟南芥AMT蛋白序列、9个白菜AMT蛋白序列和10个甘蓝的AMT蛋白序列进行比对，根据序列比对的结果，采用邻近法(NJ)构建系统进化树，Bootstrap值设定为1 000[35-36]。

1.2.4 AMT家族基因的结构分析 为了研究拟南芥和芸薹属作物AMT蛋白的结构差异，将所有的AMT蛋白序列置于MEME v5.1.1[37](http://meme-suite.org/tools/meme)中比对，以表征保守结构域。除了下列参数外，其余参数使用默认设置：最佳图案宽度设置为6～50 bp，最大保守结构域数量设置为10。使用2种不同的工具分析蛋白质的二级结构：GOR4[38](https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/page=npsagor4.html/)和PSIPRED[39](http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/PSIPRED/)。利用在线网站Phyre2[40](http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)进行同源建模，以构建蛋白质的三维结构。……