丁 奇 王建凤 王 颖 李冰宁 马立利 周欣燃 周 阳 冯月超 贾 丽 邵 鹏 刘 艳

(北京市理化分析测试中心，北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京 100089)

随着工业化不断发展，水体中污染物含量和种类逐渐增多，主要的污染物包含药物、护理用品、有机染料、内分泌干扰物等，它们严重影响人类健康和生态环境，如何获取清洁用水已成为全球性问题[1-3]。其中饮用水的安全性一直是食品安全领域最为关注的焦点问题，由于它参与机体主要的生命代谢过程直接影响着生命活动的进行，所以为了保障饮用水的干净清洁需要通过一些绿色高效的技术手段有效地去除水体中有害的物质，而高级氧化技术能有效降解污染物，主要利用氧化能力很强的羟基自由基(·OH)与有机及无机污染物发生反应，通过电子转移、亲电加成、脱氢等反应，将其降解为二氧化碳、水和其他无害物质，在污水处理、土壤修复、垃圾渗滤液处理等方面具有广泛应用，因此在食品安全及环境领域开展羟基自由基消除污染物的研究十分必要[4-6]。羟基自由基生成方法有芬顿法、紫外光催化氧化剂法、超声氧化法等，可与金属有机骨架材料(MOF)结合进一步提高产生羟基自由基速度与数量[7]。MOF是一种有机和无机杂化的周期性网状晶体，具有高比表面积、高孔隙率、孔径尺寸可调等，其灵活的材料组成和空间结构在光芬顿降解污染物领域也有较好应用[8-10]。有研究利用MIL-53(Fe)在可见光条件下激活H2O2产生羟基自由基，能有效地降解有机染料[11]。为了研究MOF在生成·OH过程中的原理及降解环境污染物方面的影响，因此对其定量检测具有重要意义。

目前，羟基自由基检测方法较多，如电子自旋共振法[12]、高效液相色谱法[13]、化学发光法[14]、分光光度法[15-16]、自动电位滴定法[17]等。韩子晗[18]等在研究林蛙卵油抗氧化性时，采用分光光度法测定羟基自由基清除率。余忆玄[19]建立高浓度氧活性粒子水射流空化高效生成-OH的新方法，以电子自旋共振法验证生成，通过高效液相色谱确定体系产率。张洪超[20]等建立羟基自由基氧化体系体，模拟乌贼肉在冻藏过程中蛋白质分子间作用力与结构的变化。由此可见羟基自由基在多个领域具有应用，因此开展羟基自由基的检测研究意义深远。

本研究通过比较检测羟基自由基的高效液相色谱法和荧光分光光度法的差异，从而探究两者的灵敏性、稳定性及适用性等。对存在金属有机骨架材料的光芬顿体系进行羟基自由基生成规律研究，探讨H2O2浓度及光照对其影响旨在为拓展降解水体中污染物方面提供理论及方法。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

对苯二甲酸(TA)，纯度99%；2-羟基对苯二甲酸(HOTP)，纯度98%；甲酸，纯度98%；磷酸二氢钾，分析纯；0.10 moL/L氢氧化钠；乙醇；富马酸，纯度99%；FeCl3·6H2O，纯度97%；30% H2O2；C18色谱柱(4.60 mm*250 mm，粒径为5.0 μm)。

1.2 仪器与设备

Elix10 Milli-Q超纯水系统；e2695高效液相色谱分析仪(2998 PDA 和2475 FLR检测器)；JB-1搅拌器；Eppendorf AG移液枪；CR22GⅢ 离心机；荧光分光光度计，F-7000 FL；自组装光反应仪器，配有500 W氙灯，光功率为65 mW。

1.3 实验原理

MIL-88A(Fe)光芬顿催化原理：在可见光照射下发生反应，反应机理[21]为式(1)～(4):

Fe3++ H2O2→ Fe2++·HOO + H+

(1)

Fe2++ H2O2→ Fe3++ ·OH + OH-

(2)

MIL-88A + hv→ h++ e-

(3)

e-+ H2O2→ ·OH + OH-

(4)

羟基自由基测定：对苯二甲酸(无色晶体，可溶于碱性溶液)与羟基自由基(·OH)1∶1反应生成具有荧光性的稳定产物2-羟基对苯二甲酸；通过测定反应液中生成2-羟基对苯二甲酸的浓度可以计算出羟基自由基的浓度；通过测定不同时间反应液中对苯二甲酸的浓度，即可反应羟基自由基的浓度[11,22]。

1.4 实验方法

1.4.1MOF的制备

称取1.16g富马酸溶解于75 mL乙醇，2.70 g FeCl3·6H2O溶解于75 mL超纯水，将上述溶液混合，在室温下搅拌24 h，离心，用水和乙醇多次洗涤产物，置于60℃干燥，得到MOF材料MIL-88A(Fe)[21]。

1.4.2反应液制备及光照实验

准确移取40 mL的0.5 mmol/L对苯二甲酸(含2.08 mmol/L NaOH)置于50 mL烧杯中，加入10 mg MIL-88A(Fe)，避光条件下磁力搅拌30 min，待达到吸附平衡后，加入不同体积的H2O2(使反应液中H2O2浓度分别为0.5 mL/L、1.0 mL/L、1.5 mL/L)，置于500 W氙灯下(反应液距离光源22 cm)进行光反应每隔10 min, 取出2 mL反应液，加入异丙醇淬灭剂，混匀，用0.22 μm滤膜过滤，运用荧光分光光度计和液相色谱分析。

1.4.3检测条件1.4.3.1荧光分光光度法

参照文献[22]测量类型为全波长扫描；扫描模式为扫描发射波长；扫描速度为2400 nm/min；PMT电压为700 V；固定激发波长在315 nm 处，扫描发射波长范围为220～600 nm，激发和发射狭缝宽度为5 nm。

1.4.3.2高效液相色谱法

(1)对苯二甲酸分析方法

色谱柱：C18色谱柱(4.60 mm×250 mm，粒径为5.0 μm)；柱温30℃；进样量1 μL；流速1.0 mL/min；检测波长425 nm ；流动相 A(甲醇)：流动相 B(1.36 mg/mL磷酸二氢钾和0.2 mL/L的甲酸水溶液)=30:70(v/v)；等度洗脱。

(2)2-羟基对苯二甲酸分析方法

色谱柱：C18色谱柱(4.60 mm×250 mm，粒径为5.0 μm)；柱温30℃；进样量1 μL；流速1.0 mL/min；荧光检测器的激发波长(λex)/发射波长(λem)： 315 nm/425 nm；流动相 A(甲醇)：流动相 B(1.36 mg/mL磷酸二氢钾和0.2 mL/L的甲酸水溶液)=30∶70(v/v)；等度洗脱。

2 结果与讨论

2.1 反应液中光生羟基自由基检测方法建立

2.1.1建立反应液中2-羟基对苯二甲酸的高效液相色谱法

通过流动相、洗脱比例优化等，建立了反应液中HOTP的测定方法。图1是HOTP的标准曲线，其线性范围为1～500 μg/L，相关系数r为0.9998，线性较好；分别添加2个浓度水平10 μg/L、50 μg/L，用于方法准确性的评估，实验结果分别为10.20 μg/L、53.96 μg/L，依据HJ 168-2010中以相对误差表示准确度，得到相对误差分别为2.00%、7.92%，该方法准确度较好；以信噪比3∶1时，考察方法的检出限为0.5 μg/L；以光照60 min时1.0 mL/L H2O2反应液中HOTP浓度来考察精密度，计算在重复性条件下2次独立测定结果的绝对差值与算术平均值的比值，其结果为5.93%。图2是测定本实验反应液(1.0 mL/L H2O2)光照60 min时HOTP的液相色谱图。

图1 HOTP的标准曲线

图2 HOTP的液相色谱图

2.1.2建立反应液中对苯二甲酸的高效液相色谱法

通过流动相、洗脱比例优化等，建立了反应液中TA的测定方法，最终得到1.4.3.2中检测TA的高效液相色谱方法。图3是TA的标准曲线，其线性范围为4～160 mg/L，相关系数r为0.9998，此方法线性较好；分别添加2个浓度水平8.0 mg/L、40 mg/L，用于方法准确性的评估，实验结果分别为7.82 mg/L、42.72 mg/L，依据HJ 168-2010中以相对误差表示准确度，得到相对误差分别为-2.25%、6.80%，该方法准确度较好；以信噪比3∶1时，考察方法的检出限为0.8 mg/L；以光照60 min时1.0 mL/L H2O2反应液中TA浓度来考察精密度，计算在重复性条件下2次独立测定结果的绝对差值与算术平均值的比值，其结果为3.53%。图4是测定本实验反应液(1.0 mL/L H2O2)光照60 min时TA的液相色谱图。

图3 TA的标准曲线

图4 TA的液相色谱图

2.2 反应液中光生羟基自由基的测定

本实验反应体系在光照射下MIL-88A催化H2O2产生羟基自由基与对苯二甲酸(TA)结合生成2-羟基对苯二甲酸(HOTP)，TA的消耗量和产生的HOTP均能间接表明羟基自由基的含量变化。

2.2.1MOF光芬顿体系对HOTP的影响

图5是随光照时间变化3种浓度H2O2反应体系中HOTP含量的变化，从图中可知暗反应30min时反应体系没有生成HOTP，表明无光照射下不能产生·OH，随后立即打开光源开始生成·OH。3种体系在光反应开始至60 min产生的HOTP均逐渐增加，但60-270 min变化趋势略有不同。当H2O2浓度为0.5 mL/L 时，HOTP浓度随光照射时间的延长而逐渐增加，在150 min后趋于平稳；而浓度1.0 mL/L和1.5 mL/L时分别在光反应时间90 min和60 min达到最大值分别为3.93 mg/L、4.10 mg/L，随后降低最终趋于稳定。在光反应0～60 min，1.5 mL/L产生的HOTP数值整体高于其它两种，最小为0.5 mL/L；光照150 min后，0.5 mL/L反应体系最高。

2.2.2MOF光芬顿体系对TA的影响

图6显示的是反应液中底物TA含量随光照时间和H2O2浓度的变化趋势。随着反应时间延长TA含量逐渐减少，在光反应0～150 min内下降趋势明显，之后逐步平稳。但不同浓度H2O2反应体系消耗TA程度略有不同，消耗量由大到小依次是1.5 mL/L、1.0 mL/L、0.5 mL/L。

图5 光照时间和H2O2浓度对生成2-羟基对苯二甲酸影的影响

图6 光照时间和H2O2浓度对消耗对苯二甲酸的影响

2.2.3反应体系对·OH的影响

结合图5和图6的结果能更有效的得出TA作为底物的MOF光芬顿体系对·OH的影响。光反应开始至150 min时，HOTP生成量及TA消耗量不断变化，共同表明产生·OH反应在不断进行，而150 min后两种物质含量保持稳定，该反应过程基本停止。由两种图得出前60min内，不同浓度H2O2体系中主要发生反应是·OH参与HOTP的生成，导致TA含量逐渐下降与HOTP生成量逐渐升高。但随着反应的继续60 min后只有0.5 mL/L的体系体现了TA消耗量、HOTP生成量与·OH含量之间的相关性，而1.0 mL/L和1.5 mL/L 的3种关系之间没有一定的规律，造成H2O2浓度越高HOTP含量越少，这种现象是由于随反应的进行自由基捕获剂对苯二甲酸逐渐减少，H2O2浓度越高的体系中积累的·OH含量越多，过量的·OH与产物HOTP发生转化或降解反应。有研究在探讨电极生成·OH规律时，发现体系中产生越多的·OH会降解HOTP，该结果与本实验一致[12]，除此之外随着紫外光照射时间延长会减缓·OH生成速率，不断增加的中间产物也会影响光催化进程，因此导致TA的含量没有全部耗尽[24]。由此得出在MOF材料和光照时间催化下H2O2浓度越高生成的·OH越多，TA作为羟基自由基载体及生成物HOTP可以间接测定·OH变化，但只适用于体系中·OH浓度较低情况。

2.3 分光光度法与高效液相法对比

荧光分光光度法和高效液相色谱法在检测羟基自由基方面均有相关应用，因此通过对本实验反应体系中HOTP的测定，探讨两种方法在此反应体系中的适用性。荧光分光光度法及高效液相色谱法的HOTP的检出限分别为5 μg/L、0.5 μg/L，2者相差10倍，由此得出高效液相色谱法的检出限较低，灵敏度较高。图7是两种方法测定反应液(1.0 mL/L H2O2)中HOTP含量的变化，由图可知不同方式测定HOTP含量随光照时间的延长而逐渐增加，表明生成·OH不断与TA结合，相同光照时间测定反应液中HOTP含量变化不大，因此这两种方法都能反映羟基自由基的含量变化。有研究也比较了分光法和反相色谱法测定羟基自由基时的灵敏度，发现分光法不能满足微量检测，而色谱法能精准的微量分析具有更高的灵敏性、精确性等[23]。综上所述，高效液相色谱法更适用于本实验反应体系中·OH的检测。

图7 分子荧光法和高效液相色谱测定HOTP浓度

3 结论

针对本实验反应体系比较了液相色谱法及荧光分光光度法检测·OH灵敏性，并对实际样品进行分析得出高效液相色谱法更适用于检测·OH。建立了MOF反应体系中羟基自由基的高效液相色谱检测方法，HOTP和TA检出限分别为0.5 μg/L、0.8 mg/L。讨论了HOTP和TA随光照时间和H2O2浓度的变化趋势，结合两种物质数据分析得出MOF和光照能协同催化·OH不断生成，但60 min后随·OH浓度的升高会抑制生成物的产生及增强了HOTP的降解效应，H2O2浓度越大该效应越强。