江光熙，高 福，陈 芸，赵思明

(1.湖北省公安县公共检验检测中心，湖北 荆州 434300； 2.江苏微康生物科技有限公司，江苏 苏州 215200； 3.华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 430070)

绿豆是我国常见的豆类之一，其营养丰富，具有良好的食用价值和药用价值。中医认为，绿豆味甘性寒，可以清热解毒，消暑利水[1]。现代研究表明，绿豆具有抗菌抑菌[2]、降血糖[3]、降血脂[4]、抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、提高免疫力等功效[7]。新近研究发现，食用绿豆可有效缓解高脂饮食小鼠的体重增加和脂质代谢紊乱，并调节肠道微生物区系的结构[8]。绿豆经萌发后其营养组成发生改变，容易被人体吸收，同时该过程还可富集酚类、异黄酮和γ-氨基丁酸等对人体有生理功能的活性物质，减少或消除抗营养因子[9-12]。

随着人们健康意识逐渐增强，消费观念随之转变。谷物饮料因具有天然、绿色、营养、健康的特点，符合饮料市场发展潮流和趋势，从而受到越来越多人的青睐。益生菌发酵不仅可以改善产品的风味、口感等，还可以促使结合态活性成分的释放，从而发挥更好的营养和健康效益[13-15]。我们以萌发的绿豆为原料，利用课题组筛选的卡斯特酒香酵母和植物乳酸杆菌对其进行发酵，主要研究复合菌种发酵工艺条件对绿豆浆品质的影响，以期为发酵绿豆浆的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿豆，中绿1号，购于湖北省种子管理局商业中心；卡斯特酒香酵母(Brettanomycescustersii)ZSM-001(专利号：ZL2007100536112)和植物乳酸杆菌(Bourdichonplantarum)ZSM-002(专利号：ZL2009100638581)均由中国典型培养物保藏中心提供。

LRH-150B型生化培养箱，广东省医疗器械；HD-1360型水平流超净工作台，哈尔滨东联仪器公司；722S型可见光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TDL-S-A型台式离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1试验用菌种的制备

取冷藏的酵母和乳酸菌株，在无菌操作台中分别从斜面中取2～3环接种到土豆液体培养基和MRS液体培养基中30℃下培养24 h，其中酵母菌在摇床中培养。液体培养结束后，分别从液体培养基中钩出1环接种到相应的固体平板中，在30℃下培养48 h使菌活化。取活化菌种2～3环接种到相应的液体培养基中，在30℃下培养48 h，其中酵母菌在摇床中培养。培养结束后，将菌液在4 000 r/min下离心5 min，离心结束后倒去培养液，收集菌泥(乳酸菌水分约为72.3%，酵母菌水分约为66.7%)备用。

1.2.2发酵绿豆浆的制备

称取一定量无破损绿豆，用自来水冲洗干净后用0.1%的次氯酸钠浸泡10 min进行消毒，再用自来水冲洗干净，加入3倍体积的硫酸锌溶液(浓度150 mg/L)浸泡5 h，沥干后置于已消毒的发芽器中发芽16 h (发芽温度25℃，湿度90%～99%)，发芽结束后用蒸馏水清洗2次，按照液豆重量比1∶2加入营养液(10 mmol/LL-谷氨酸钠，0.2 mmol/L CaCl2)，用碎冰机磨浆2 min。将经过2次活化2次扩大培养的ZSM-001酵母菌与ZSM-002植物乳酸菌按照一定比例和添加量加入到绿豆浆中于一定温度下发酵。

1.2.3发酵条件的优化

1.2.3.1单因素试验

分别研究乳酸菌和酵母菌菌种比例、接种量、糖添加量、发酵时间、发酵温度对绿豆浆感官品质的影响。

1.2.3.2正交试验

根据上述单因素试验结果，以复合菌比例、接种量、加糖量、发酵时间、发酵温度为因素，选取4个水平，以发酵绿豆浆的pH值、酸度、GABA含量、植酸含量、感官评定为指标进行五因素四水L16(45)正交试验，确定最佳发酵条件。

1.2.4品质评价指标的测定

1.2.4.1感官评定

由5位食品专业人员组成感官评定小组，对绿豆浆的组织状态、色泽、气味分别进行评价后再对绿豆浆进行综合评定，感官评定标准见表1。

表1 发酵绿豆浆感官评定标准

1.2.4.2酸度的测定

称取搅拌均匀样品5.0 g于150 ml三角瓶中，加入 40 ml 新煮沸并已冷却至约 40℃的蒸馏水混匀，再加入5滴酚酞指示剂，用浓度为0.1 mol/L氢氧化钠滴定至微红色，30 s内不消失为滴定终点，记录消耗氢氧化钠体积V。酸度=V×20(°T)。

1.2.4.3GABA含量的测定

称取绿豆5.0 g加水研磨后定容至50 ml。于30℃下水浴浸提2 h后4 000 r/min离心10 min，用0.25 μm微孔过滤膜过滤，取滤液0.6 ml于25 ml，加入0.2 ml 0.2 mol/L硼酸-硼酸钠缓冲液(pH9.0)，1 ml 6%苯酚溶液，0.4 ml次氯酸钠(活性氯质量分数5.25%)，振荡沸水浴10 min后立即冰水浴20 min(有蓝绿色化合物出现)，加入2 ml 60%乙醇溶液于645 nm下比色，测吸光值。根据吸光度查标准曲线，求出样品中GABA含量。标准曲线是通过配制0,0.025、 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/ml的GABA标准溶液，按照上述方法测定其吸光度，以浓度为横坐标x，以吸光度为纵坐标y绘制的标准曲线回归方程为：y=3.986 3x-0.017 7(R2=0.995 6)。

1.2.4.4植酸的测定

采用GB/T 5009.153—2016的方法测定。

1.2.5数据处理

采用Excel 软件和SAS V8软件进行数据处理和分析，显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1复合菌种比对绿豆浆感官品质的影响

复合菌种比对发酵绿豆浆感官品质的影响见表2。

表2 复合菌种比对发酵绿豆浆感官品质的影响

由表2可知，复合菌种比对发酵绿豆浆的组织状态和色泽无显著影响，对发酵绿豆浆的气味和综合评分有显著影响。在乳酸菌∶酵母菌为2∶3时，发酵绿豆浆的综合评分和气味评分均最高，在菌种比为1∶0时最低。随着乳酸菌含量的减少、酵母菌含量的增大，气味和综合评分呈先增大后减小趋势，这可能是因为乳酸菌产生的乳酸与绿豆浆中的挥发性物质混合使绿豆浆产生异味，而酵母菌利用中链脂肪酸及脂类氧化产物产生的醇类、酸类物质具有果香味，使绿豆浆具有良好发酵气味；但酵母菌添加量过大时，又使绿豆浆产生异味，导致评分降低。适宜的乳酸菌与酵母菌比例为2∶3～1∶2。

2.1.2接种量对发酵绿豆浆感官品质的影响

接种量对发酵绿豆浆感官品质的影响见表3。

表3 接种量对发酵绿豆浆感官品质的影响

由表3可知，接种量对发酵绿豆浆的色泽无显著影响，但对发酵绿豆浆的组织状态、气味和综合评分有不同程度的影响。随着接种量增加，绿豆浆发酵气孔越来越密集，其组织状态评分增高。发酵绿豆浆的气味和综合评分随着接种量增加呈先升高后降低的趋势，在总接种量为0.6%时，两者评分最高。适宜的接种量为0.2%～1.4%。

2.1.3加糖量对发酵绿豆浆感官品质的影响

接种量对发酵绿豆浆感官品质的影响见表4。

表4 糖添加量对发酵绿豆浆感官品质的影响

由表4可知，加糖量对发酵绿豆浆的色泽无显著影响，对发酵绿豆浆的组织状态、气味和综合评分有不同影响。随着加糖量的增加，发酵绿豆浆的组织状态评分逐渐升高，气味和综合评分呈先升高后降低的趋势，在加糖量为3%时，气味和综合评分达到最大值。适宜的加糖量范围为3%～5%。

2.1.4发酵时间对发酵绿豆浆感官品质的影响

发酵时间对发酵绿豆浆感官品质的影响见表5。

表5 发酵时间对发酵绿豆浆感官品质的影响

由表5可知，随着发酵时间的延长，绿豆浆组织状态评分逐渐升高，气味和综合评分均先升高后降低，在发酵4 h时，气味评分和综合评分均最高。这可能与菌体对营养物质的利用和代谢产物的积累有关。适宜的发酵时间为4～5 h。

2.1.5发酵温度对发酵绿豆浆感官品质的影响

发酵温度对发酵绿豆浆感官品质的影响见表6。由表6可知，随着温度的升高，绿豆浆的组织状态评分逐渐升高，而色泽、气味和综合评分均先升高后降低。在发酵温度为30℃时，色泽、气味和综合评分均达到最大值。适宜的发酵温度约为30℃。

表6 发酵温度对发酵绿豆浆感官品质的影响

2.2 正交试验结果

以复合菌种比、接种量、加糖量、发酵时间和发酵温度为因素设计正交试验L16(45)，以发酵绿豆浆的pH值、酸度、GABA含量、植酸含量、感官综合评分为指标确定最佳发酵条件，试验结果见表7。对试验结果进行方差分析，结果见8。

表7 正交试验设计及结果

由表8可知，影响发酵绿豆浆pH值和酸度的因素按主次顺序为：B>A>C>D>E，且各因素影响水平均为极显著(P<0.01)；影响发酵绿豆浆GABA含量的因素按主次顺序为：D>B>E>A>C，且B、D的影响水平为极显著(P<0.01)，A、C、E的影响水平为显著(P<0.05)；影响发酵绿豆浆的植酸含量因素按主次顺序为：E>D>B>A>C，且A、B、D、E的影响水平为极显著(P<0.01)，C因素不具有显著性(P>0.1)；影响发酵绿豆浆感官综合评分的因素按主次顺序为：A>B>D>E>C，且A、B、D的影响水平为极显著(P<0.01)，E的影响水平为显著(P<0.05)，C的影响水平不显著(P>0.1)。

表8 正交试验方差分析表(F/P)

正交试验均值分析表见表9。

由表9可知，以GABA含量为评价指标，最佳发酵条件为A2(A3，A4)B3(B4)C3D3(D4)E1(E2)，即复合菌种比为1∶1(2∶3，1∶2)，接种量为1.0%(1.4%)，加糖量5%，发酵时间为5 h(6 h)，发酵温度为20℃(25℃)。以植酸为评价指标，最佳发酵条件为A3B2C3D1E2，即复合菌种比为2∶3，接种量为0.6%，加糖量5%，发酵时间为3 h，发酵温度为30℃。以感官综合评分为评价指标，最佳发酵条件为A3B3C4D3(D4)E3(E4)，即复合菌种比为2∶3，接种量为1.0%，加糖量7%，发酵时间为5 h(6 h)，发酵温度为35℃(40℃)。综合各因素的重要性，最优发酵条件为A3B3C3D3E2，即复合菌种比为2∶3，接种量为1.00%，加糖量为5%，发酵时间为5 h，发酵温度为30℃。

表9 正交试验均值分析表

2.3 验证试验结果

验证试验结果见表10。

由表10可知，工艺1的pH值和植酸含量均明显高于工艺2和工艺3，酸度、GABA和综合评分均低于工艺2和工艺3，说明发酵条件对绿豆浆的pH值、酸度、GABA含量、植酸含量和综合评分均有显著作用。工艺2的GABA含量和感官综合评分明显高于工艺3，工艺3的植酸含量与工艺2无显著性，由此确定最佳发酵条件为工艺2，即复合菌种比为2∶3，接种量为1.0%，加糖量为5%，发酵时间为5 h，发酵温度为30℃，此时γ-氨基丁酸含量可达129.53±1.70 mg/(100 g)，植酸含量减少至1.29±0.13 mg/g。与未发酵的样品相比，γ-氨基丁酸含量增加了39.6%，植酸含量减少了54.1%。

表10 验证试验结果

3 结论

本试验利用卡斯特酒香酵母ZSM-001和植物乳酸杆菌ZSM-002进行复配，在研究复合菌比例、接种量、糖添加量、发酵时间和发酵温度对发酵绿豆浆的感官品质影响的基础上，进行了发酵工艺条件优化研究，确定了适宜的发酵工艺条件为乳酸菌与酵母菌复合菌种比2∶3，接种量1.0%，加糖量5%时，于30℃下发酵5 h。采用该工艺所得产品中γ-氨基丁酸含量可达129.53 mg/(100 g)，植酸含量减少至1.29 mg/g。