冯欣欣，李凤兰，徐永清，李 磊，贺付蒙，冯艳忠，袁 强，*，刘 娣，*

(1.东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030； 2.黑龙江省农业科学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

农作物秸秆富含纤维素，它是一种具有巨大开发潜力的可再生生物资源，东北地区作为我国的重要农作物种植区之一，每年会形成大量的农作物秸秆，受到低温的影响，秸秆的酵解在自然条件下无法实现，秸秆不能正常还田，造成秸秆资源的巨大浪费[1]。

近年来发现的能够降解秸秆纤维素的微生物有200种以上[2]，产纤维素酶的微生物在真菌、细菌和放线菌等都有分布[3]。研究发现，能够分泌纤维素酶的细菌包括纤维杆菌属(Cellulomonas)和梭菌属(Clostridium)等[4]；能够分泌纤维素酶的真菌包括木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)等[4-7]；能够分泌纤维素酶的放线菌包括纤维放线菌(Acidothermuscellulolyticus)[8]、链霉菌属(Streptomyces)[9]。高寒等极端环境中也存在产纤维素酶的微生物，如黄玉兰等[10]从若尔盖高寒地区筛选到了耐低温的高效产纤维素酶的细菌，在5 ℃时仍能保持56%的酶活性；王继莲等[11]从自东帕米尔高原布伦口湖群湿地中分离到一株高酶活低温纤维素酶产生菌，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，10 ℃低温条件下保持繁殖能力，在20 ℃，pH 7.0条件下发酵72 h，酶活性达到最大值28.7 U·mL-1。我国秸秆的综合利用主要包括秸秆还田、秸秆造纸、秸秆发电等[12]。采用微生物发酵降解的方法，其降解还田有利于土壤有机质的提高，增加土壤肥力，施加秸秆腐熟剂可以使秸秆腐解速度加快、使秸秆中的养分释放到土壤中，增加土壤有益微生物的数量，改善土壤理化性质[13-15]，还能有效降低秸秆直接还田给农作物带来的危害[16]。因此，通过筛选出在低温下具有较强纤维素降解能力的菌种，对秸秆进行生物酵解，实现对秸秆的合理利用并进行秸秆的生物发酵，具有重要的前景和研究价值。

阿勒泰地区，位于新疆北部，冬季漫长且寒冷，年均气温0.2～4 ℃，1981—2017年平均气温为4.9 ℃，年极端最低温度最低是2001年，为-41.7 ℃，因此，新疆阿勒泰地区独特的气候条件可能蕴藏着丰富的低温微生物[17]。以新疆阿勒泰地区寒冷地区(冬季最低温度可以达到-45 ℃)腐烂的云杉树干为试验材料，筛选低温条件下产纤维素酶的高效菌株，对其进行形态学和分子生物学鉴定；探讨这些菌株的耐冷性及产纤维素酶的影响因素，并进行酵解试验，确定其分解秸秆的能力，通过以上研究为寒地秸秆腐熟菌剂的菌种筛选及秸秆腐熟技术应用提供实践基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新疆阿勒泰地区最高峰海拔在4 000 m以上，冬季最低温度可达-45 ℃。本研究以新疆阿勒泰地区海拔2 300 m的腐烂云杉树树干为材料(图1)，进行低温腐熟菌筛选。秸秆采自东北农业大学试验田。

图1 腐烂的云杉树树干Fig.1 Rotten trunk of spruce trees

1.2 试验方法

1.2.1 新疆寒冷地带腐烂云杉树树干中菌株的分离、初筛

菌株的分离。将样品采用梯度稀释分离法依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的梯度样品溶液。将样品溶液均匀涂布至整个平板，观察各梯度菌株生长状况，进行分离纯化，得到单菌落。

菌株的初筛。采用不同温度对富集分离的菌株进行初筛，分别在4、10、15、25和37 ℃培养所分离的菌株，观察菌株生长情况，筛选出能在低温条件下正常生长的菌株。

1.2.2 低温条件下产纤维素酶菌的复筛

将初筛获得的可在低温条件下生长的菌株接

种在CMC-刚果红培养基上进行培养，观察培养基上透明圈大小，计算透明圈与菌株直径之比，其可反映酶浓度的相对高低[18]。

1.2.3 产纤维素酶菌的鉴定

将复筛得到的真菌菌株分别接种于PD培养基和PDA培养基中，28 ℃培养3～4 d，待菌丝长出后，观察菌落及菌斑的形状和外观，利用光学显微镜观察菌丝及分生孢子形态。菌株 DNA 提取采用专用的基因组DNA提取试剂盒。DNA提取成功后，经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并检测纯度，置于-20 ℃保存备用。利用真菌鉴定的ITS序列通用引物ITS1/ITS4，进行PCR扩增。将PCR产物送至哈尔滨博仕生物技术有限公司进行测序。将测序获得的序列输入GenBank中，利用BLAST比对，进行序列同源性分析，并采用MEGA5.0软件构建系统发育树，对真菌的种属进行分子鉴定。

1.2.4 产纤维素酶菌的耐冷性鉴定

将前期筛选和鉴定后获得的低温产纤维素酶的真菌接种于PDA培养基，记录菌株在4、10、15、20、25、30和35 ℃的培养条件下的生长状况，确定筛选的菌株的耐冷性。

1.2.5 产纤维素菌的产酶条件优化

单因素实验。本实验采用赫奇逊氏无机盐培养基作为基础培养基，依次对培养基氮源(蛋白胨、酵母膏、硫酸铵和尿素)、接种量(1%、3%、5%、7%、9%)、培养基初始pH(4、5、6、7、8、9、10)、温度(10、15、20、25、30、35、40 ℃)及培养时间(3、6、9、12、15、18 d)进行优化，其余培养条件不变，培养7 d时，测定纤维素酶活性，确定最佳因素且后续单因素实验均在前一单因素实验的较优结果上进行。

纤维素酶(CMC)活性测定。先制作葡萄糖标准曲线，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的0.1%的葡萄糖标准溶液于干净的试管中，用蒸馏水补齐至2 mL，再加入DNS显色液1.5 mL，沸水浴10 min后冷却，并用蒸馏水定容至15 mL，混匀后540 nm下测定其吸光值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标制作曲线并建立回归方程绘制标准曲线。得到回归方程是y=1.189 2x-0.058 4，R2=0.996 7。由回归方程得出，吸光度和葡萄糖含量之间相关性良好。

CMC活性测定采用DNS法，将1.8 mL 1% CMC溶液置于干净的试管中50 ℃水浴预热5 min，加入0.2 mL适当稀释的待测反应酶液50 ℃反应30 min，然后立即加入2 mL DNS试剂，置于沸水浴中显色10 min，冷却后用蒸馏水定容至15 mL，混匀后在540 nm处比色测定吸光度。在上述反应条件下，1 min反应水解生产1 μmol葡萄糖的酶量为1个酶活性单位(U·mL-1)。

1.2.6 低温产纤维素菌酵解试验

秸秆培养基酵解试验。先将所取的秸秆剪成2 cm小段后用水浸泡过夜后烘干，称取5 g秸秆段放入到250 mL三角瓶中，加入(NH4)2SO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.05 g，每瓶加5 mmol·L-1pH 7.0的磷酸缓冲液(PBS)15 mL。每瓶分别加入各菌株2 mL的菌悬液，用不接菌的作为对照组，混匀后置于20 ℃的恒温培养箱，设置3组重复，10 d测定降解率(D)。用无菌蒸馏水洗去菌体和孢子，过滤，将剩余物置于105 ℃烘箱中烘干至恒重，用电子天平称量未被降解的秸秆质量记为m1(g)，发酵前的质量记为m0(g)，则降解率D(%)=(m0-m1)/m0×100。

秸秆小盆酵解试验。将玉米秸秆、水稻秸秆和大豆秸秆分别剪成2 cm左右的秸秆段，装入小盆中，用无菌水浸泡1 d后，加入所筛选出的低温产纤维素酶菌株，分别等体积添加到各小盆中，每组设置3组重复，放到20 ℃环境中，保持水分充足，每天进行观察和统计，计算其降解率，计算方法同上。

1.3 数据处理

所得试验数据及分析结果均采用Microsoft Excel录入，并作图。采用SPSS 17.0软件进行统计分析，对所得实验数据分别相应的采用独立样本T检验及单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 低温产纤维素酶菌的筛选

2.1.1 低温产纤维素酶菌的初筛

对新疆树木中的微生物进行了6次分离和纯化，共获得了21个菌株。在不同温度培养条件下，对分离的菌株进行培养，观察其生长情况，进行低温产纤维素的初筛(表1)。结果表明，筛选出的能够在4 ℃低温条件下正常生长的菌株共有10株。其中，细菌4株，分别命名为F1、F2、D1、D4；真菌6株，分别为P1、P4、N5、T2、T7、T8。

表1 低温产纤维素酶菌株的初筛结果Table 1 Screening results of low temperature cellulase producing strains

2.1.2 低温产纤维素酶菌株的刚果红培养基复筛

对初筛得到的能在低温条件下正常生长的10株菌通过CMC-刚果红固体培养基进行复筛，通过培养基上的透明圈及透明圈直径大小确定其产纤维素酶能力。结果表明，只有真菌P1、T2、N5、T8菌株能在刚果红培养基上产生透明圈(图2)，透明圈直径与菌落直径之比分别为2.54、2.05、1.35、2.32，而其他4株细菌和2株真菌没有产生透明圈。

2.2 低温产纤维素酶菌的形态学观察

将筛选出的4个产纤维素真菌P1、T2、N5、T8在固体培养基上培养，观察菌落及菌体显微形态。结果表明，在培养基上都形成单一的真菌菌落。菌株P1的菌落呈蓝绿色，具辐射状皱纹，边缘菌丝体白色，质地绒状(图3-A)。菌株T2的菌落呈黄白色，边缘菌丝体为白色，质地绒状(图3-B)。菌株N5菌落呈淡黄色和白色，质地绒状(图3-C)。菌株T8菌落呈白色，质地绒状，边缘菌丝体呈白色(图3-D)。各菌体显微形态见图4。

A，P1；B，T2 ；C，N5；D，T8.图2 产纤维素酶真菌CMC-刚果红培养基上产纤维素菌的透明圈Fig.2 Transparent circle of cellulose producing fungi on CMC-Congo red medium

2.3 低温产纤维素酶菌的分子鉴定

通过真菌ITS序列分析，对筛选获得的产纤维素菌进行分子生物学鉴定，其中，真菌菌株P1、

A，P1；B，T2 ；C，N5；D，T8.图3 产纤维素真菌的菌落形态Fig.3 Colony morphology of the cellulose producing fungi

A，P1；B，T2；C，N5；D，T8.图4 产纤维素真菌的显微形态Fig.4 Microscopic morphology of the cellulose producing fungi

T2、N5、T8扩增获得的ITS序列片段长度分别为579、626、581和609 bp。

将获得的序列进行BLAST比对及系统发育树构建，结果如图5-图8所示。根据系统发育树的结果，确定P1为产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)，T2、T8为桔绿木霉(Trichodermacitrinoviride)，N5为脉纹孢菌(Neurosporasitophila)，这个鉴定结果和前面的形态学鉴定结果一致。

图5 菌株P1基于18S rDNA序列同源性构建的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of strain P1 based on 18S rDNA sequences homology

图6 菌株T2基于18S rDNA序列同源性构建的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strain T2 based on 18S rDNA sequences homology

图7 菌株T8基于18S rDNA序列同源性构建的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of strain T8 based on 18S rDNA sequences homology

图8 菌株N5基于18S rDNA序列同源性构建的系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree of strain N5 based on 18S rDNA sequences homology

2.4 低温产纤维素酶菌的耐冷性鉴定

对筛选获得的4个菌株进行耐冷性鉴定。将筛选的真菌菌株P1、T2、T8和N5 接种在PDA培养基上，在不同温度下进行培养，观察其菌株生长情况。结果表明，4个菌株在5 ℃时均可以生长，耐冷性强。根据Morita的定义，耐冷微生物具有的特征为在0～5 ℃能够生长繁殖，最适生长温度在15 ℃以上，最高生长温度高于20 ℃。本试验筛选获得的4个产纤维素菌株均为耐冷微生物，可以在北方低温地区正常生长。

2.5 低温产纤维素酶菌产酶条件优化

2.5.1 最佳氮源筛选

对筛选的4个低温菌产纤维素酶的最佳氮源进行筛选。结果如图9所示，由结果可以看出，4个真菌在以蛋白胨和酵母膏为氮源培养基上产纤维素酶的活性较高，而在添加硫酸铵和尿素作物氮源培养基上产生纤维素酶的活性较低，差异显著。综合比较结果，适合于4种低温产纤维素菌产纤维素酶的培养最佳氮源为蛋白胨。

2.5.2 接种量对产酶的影响

不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。The different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05). The same as below.图9 不同氮源对4菌株产酶的影响Fig.9 Effect of differernt nitrogen fountains on cellulase production of four strains

对筛选的4个低温菌产纤维素酶的培养最佳接种量进行筛选，结果如图10所示。由结果可以看出，接种量的不同会影响真菌产纤维素酶的活性，随着接种量的增加，低温产纤维素酶的活性呈现先急剧上升再缓慢下降的趋势，在接种量为3%～9%时，4个真菌都具有较高纤维素酶活性，接种量为5%时，都具有最高的产酶活性，接种量超过5%后，酶活性开始下降。综合比较结果，4种低温菌产纤维素酶的最佳接种量均为5%。

图10 不同接种量对4菌株产酶的影响Fig.10 Effect of different inoculum on cellulase production of four strains

2.5.3 温度对产酶的影响

由图11可知，4种菌株在10～25 ℃时酶活性逐渐增加，到25 ℃时酶活性最高，超过25 ℃酶活性开始呈显著下降，40 ℃时4个菌株的产酶活性都降到最低。综合比较结果，确定4种低温菌产纤维素酶的最佳温度为25 ℃。

图11 不同温度对4菌株产酶的影响Fig.11 Effect of different temperature on cellulase production of four strains

2.5.4 初始pH对产酶的影响

由图12可看出，液体培养的培养基初始pH对筛选的4个真菌菌株产纤维素酶活性影响较大。过酸或过碱的环境纤维素酶活性都很低，4种菌在pH值为3时，酶活性降到了最低，几乎无法检出纤维素酶活性。培养基初始pH在6～8时，4种菌株的纤维素酶活性都表现为较高的水平，在初始pH为7时，纤维素酶活性最高，当培养基初始pH升至8时，4个菌的产酶活性都呈下降趋势。这些结果表明，本试验筛选的低温产纤维素菌的产酶最佳初始pH为7，中性溶液环境有利于其产酶。

图12 不同培养基初始pH对4菌株产酶的影响Fig.12 Effect of initial pH on cellulase production of four strains

2.5.5 培养时间对产酶的影响

由图13可以看出，4种菌株的产酶活性随着培养时间的延长，表现为先呈现快速上升，然后缓慢下降的趋势，在培养9 d的时候，都具有最好的产酶活性，12 d后纤维素酶活性逐渐降低，呈现为显著性差异，但仍具有较强的酶活。综合比较结果，确定4种低温菌产纤维素酶的最佳培养时间为9 d。

图13 不同培养时间对4菌株产酶的影响Fig.13 Effect of incubating time on cellulase production of four strains

2.6 低温产纤维素酶菌的秸秆酵解效果

将本试验筛选获得的4个低温产纤维素酶菌接种到玉米秸秆培养基中进行秸秆酵解试验。试验结果如图14所示，随着酵解时间的延长，4种菌可以有效进行玉米秸秆酵解。秸秆小盆酵解实验结果表明，在酵解15 d时，玉米秸秆失重率最大，达到了40%以上(图15)。综上，本试验筛选的4个低温产纤维素酶菌对秸秆具有酵解作用。

图14 四种真菌菌株酵解玉米秸秆的失重率Fig.14 Weight loss rate of corn straw fermented by four fungal strains

图15 四种真菌菌株酵解不同秸秆的失重率Fig.15 Weight loss rate of different straws fermented by four fungal strains

3 结论与讨论

3.1 低温产纤维素酶菌的筛选

在低温菌筛选过程中，通过把初筛的菌种接到相适应的培养基后，放入到低温环境中观察其生长状态，如果能够正常生长，则表明其具有耐低温的能力[19]。王玢等[20]从黄海的深海海底泥样中筛选出一株产纤维素酶的海洋细菌，初步鉴定为革兰氏阴性杆菌，此菌最适生长温度为20 ℃，最高生长温度为40 ℃，但把其放在0 ℃条件下，也能正常生长，确定其为嗜冷菌。黄玉兰等[10]从若尔盖高寒湿地土壤中筛选出一株纤维素酶高产菌株为缺陷短波单胞菌(XW-1)，最适生长温度为20 ℃，15 ℃时相对酶活达到80%，在5 ℃时仍然具有较高产酶特性。本实验选用新疆高寒地区的腐烂云杉树干为试验材料，筛选得到产纤维素酶的真菌，这些真菌虽然最适生长温度为25 ℃，但是在4 ℃低温条件下，依然能够正常生长，为典型的低温菌。

在低温菌复筛过程中采用的CMC-刚果红培养基筛选的方法，该方法是利用刚果红可以和结构中含有β-1，4-D-吡喃型葡萄糖的多糖发生反应，形成颜色浓郁的多聚糖-刚果红复合物，在微生物培养过程，会分泌纤维素酶分解纤维素，产生葡萄糖，这个过程会减少多聚糖-刚果红复合物的产生形成透明圈，因此，通过是否产生透明圈，可以初步判定是否有纤维素降解菌的的存在。在本试验中，对筛选的10株低温菌进行复筛试验时，发现接种在刚果红培养基上后，有的能够正常生长，且菌落较大，却没有产生降解圈或降解圈太小太暗。只有4株真菌产生了透明圈，表明其可以产生纤维素酶，但是，降解圈的大小只能在一定程度上反映产纤维素的能力，具体产纤维素酶的活性还需要进行酶活性测定。

3.2 低温产纤维素酶菌最佳产酶条件的筛选

同一株菌株在不同的条件下，其生长代谢速率和产酶效果不同。2013年穆春雷[21]从秸秆还田土壤中分离出一株在13 ℃低温环境下高效分解纤维素的草酸青霉(M11)，该酶最适pH为5.0，最适反应温度为20 ℃，在5～20 ℃时酶活性仍能保持在90%以上。2015年邵娜娜等[22]从内蒙古大青沟采集的森林土壤中分离了1株产纤维素酶的耐低温菌为链霉菌属的放线菌(ND2-1)，该菌株产纤维素酶在pH 3.0～9.0范围内稳定，且酶活性都较高，最适反应pH为7.0，最适反应温度为30 ℃，K+和Cu2+对酶活性有抑制作用，Mn2+能提高相对酶活性至166.7%。本实验选取了培养基氮源、培养时间、培养温度、pH和菌株接种量，5个影响低温菌产纤维素酶活性的因素，探讨了筛选的菌种的产酶条件，表明本实验筛选的菌种可以在较低的温度下产纤维素酶，并且受pH值的影响较大，中性条件下更适合其产酶，表明这些菌在应用中具有广泛性。

3.3 低温菌秸秆酵解分析

秸秆在酵解过程中，通过酶的作用下，秸秆的质量会发生改变。王元明[23]筛选出两株高效纤维素降解的放线菌(F1、F2)，研究表明，在50 ℃条件下，采用这些菌单独处理秸秆10 d后，其失重率都在20%以上，采用两株菌混合培养液对水稻秸秆进行降解时，其失重率可以达到31.27%。段杰[24]获得了3株纤维素降解能力比较高的菌株，其中2株为木霉属，1株为青霉属。进行了菌株酵解试验表明，通过构建混合菌系降解秸秆的失重率可以达到 34.52%。本实验对筛选的低温产纤维素酶菌株进行了秸秆酵解试验，结果表明，本研究筛选获得的菌株在低温条件下都具有酵解秸秆的能力，并且，这些菌株对玉米秸秆、大豆秸秆和水稻秸秆都具有酵解作用，不同菌株对秸秆的作用有所差异，对玉米秸秆酵解效果最好，秸秆失重率都在40%以上，特别是枯绿木霉菌株(T2)对玉米秸秆的酵解能力最强，达到了47%以上。这些结果表明，本研究筛选的低温菌可以应用于纤维素含量较高的秸秆酵解。本实验只是选择了3种秸秆材料进行酵解试验，因此，还需要进一步研究这些菌株对于其他类型的秸秆的酵解能力及田间的试验效果。