赵洪喜，刘继兵

(宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

牛球虫属于原生动物门(Sporozoa)复顶亚门(Apicomlexa)孢子虫纲(Sporozoa)球虫目(Coccidia)艾美尔科(Eimeriidae)艾美尔属(Eimeria)和等孢子属(Isospora)[1]。奶牛球虫病主要由艾美尔属球虫引起，目前已报道的牛球虫种类共有21种，在中国共有13种，其中大部分为低致病性，只有牛艾美尔球虫和邱氏艾美尔球虫能够引起犊牛严重疾病[2-4]；放牧条件下，阿拉巴艾美尔球虫被认为是优势虫种。奶牛球虫病主要危害3周到12个月的犊牛，临床上以水样和血样粪便为主，有时会出现肠黏膜破坏、腹痛、发热、脱水、虚弱、厌食和体重减轻等并发症[5]。成年奶牛以亚临床表现为主，但其排泄的球虫卵囊会长期存在于养殖环境，引起奶牛场潜在损失，导致动物饲料消耗增多、营养不良、生长不良和体重下降等[6]。奶牛球虫病给世界各地的畜牧业造成了巨大的经济损失。Koutny等[7-8]报道，在全球范围内每年因球虫造成的损失约为7.23亿元。

奶牛业作为宁夏的支柱和优势产业，其平均奶产量和奶牛单产均位居国内前列；但在奶牛的养殖过程中，由于技术、人员、条件等因素的限制，对奶牛球虫病的检测与诊断、流行病学、防控技术等方面了解和认识不够，以及缺少必要的疫苗，使得该病在奶牛养殖过程中时有发生，严重影响奶产业的健康发展。本研究对宁夏部分规模化奶牛场的球虫病发病情况进行调查，并对阳性样品进行培养和鉴定，同时进行18S rRNA基因的克隆、测序与进化分析，为从分子水平上研究宁夏地区奶牛球虫的进化关系、确定其分类学地位提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 粪样采集

2019年6—10月从宁夏吴忠、石嘴山、贺兰地区5个不同规模化奶牛场采集新鲜犊牛腹泻粪便样品179份，分别装入自封袋带回实验室检测。

1.2 检测方法

利用饱和NaCl溶液飘浮法和麦克马斯特虫卵计数法记录并统计球虫形态与种类。具体方法如下：称取2 g粪便加入盛有20 mL饱和NaCl溶液的烧杯中，充分搅拌均匀后静置10～20 min，用60目铜筛过滤，弃掉滤渣。吸取适量滤液滴注于改良麦氏虫卵计数板中，显微镜下统计每g粪便卵囊数(OPG)(NOPG=A×200，A为改良麦氏记数板下数到的卵囊数)，每个粪样检测3次，取平均值。

1.3 卵囊形态观察与鉴定

将显微镜观察有球虫卵囊的阳性粪样放入1 000 mL烧杯中，加适量饱和NaCl溶液，用玻璃棒捣碎并充分混匀，静置20 min。经60目铜筛过滤，将滤液以4 000×g离心20 min。弃沉淀。取上清液，加10倍的清水，4 000×g离心20 min，弃上清液，取沉淀放入装有2.5%重铬酸钾溶液的培养皿中，置于28 °C恒温箱中培养使其完全孢子化。然后将孢子化后的卵囊液置于Motic光学显微镜下观察孢子化卵囊的结构，按照符敖齐等[9]和Florião等[10]的方法，通过观察卵囊、孢子囊和子孢子的形态、颜色、大小等，对奶牛球虫进行鉴定。

1.4 卵囊基因组DNA提取

参考龚振兴[11]的方法，取适量卵囊液，加入直径0.5 mm的玻璃珠，置于旋涡振荡仪上振荡10 s，至镜检时视野中95%以上的卵囊壁破碎为止。用基因组DNA提取试剂盒提取孢子化卵囊DNA，保存于-20 ℃备用。

1.5 18S rRNA基因片段的PCR扩增

根据Genbank公布的牛艾美尔球虫属的18S rRNA序列设计1对通用引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下：上游引物：5′-GATACCGTCGTAATCTCTACCATAA-3′；下游引物：5′-ATCCATTGCTGAAAGTTTTTCTACT-3′。PCR扩增反应体系50 μL：Premix ExTaq25 μL，上、下游引物(20 μmol·L-1)各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O补至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸8 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增结果。

1.6 18 S rRNA基因克隆与序列分析

扩增产物用Agarose Gel DNA Puirfication Kit (TaKaRa)试剂盒切胶回收，并将回收产物与T-easy vetor(Promega)连接。连接产物转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，用含氨苄青霉素抗性的LB培养基筛选阳性克隆，阳性克隆经PCR鉴定、测序。测序结果用BLASTn和DNAstar软件比对分析，将与该序列相似度较高的GenBank中已登录的序列下载至本地，利用MEGA7软件进行多序列比对，并进行同源性分析和系统进化树构建。

2 结果与分析

2.1 宁夏地区奶牛球虫感染情况

2.1.1 不同奶牛场球虫感染率与OPG值

由表1可知，宁夏吴忠、石嘴山、贺兰地区5个规模化奶牛场均存在球虫感染，感染率分别为50.00%、80.84%、50.50%、55.56%和40.00%，平均感染率为56.98%。在检出的99头阳性奶牛中，最大的OPG值为4 800。各奶牛场平均OPG值为1 358，其中牧场2的最高，平均OPG值为2 752(表1)。

表1 奶牛场球虫感染率与OPG值Table 1 Infection rate and OPG of coccidia in dairy farms

2.1.2 球虫卵囊的鉴定

根据符敖齐等[9]的球虫鉴别方法，对奶牛场阳性样品的孢子化卵囊进行了初步鉴定。结果显示：5个奶牛场共存在6种艾美尔属奶牛球虫(图1)，即牛艾美尔球虫(Eimeriabovis)、邱氏艾美尔球虫(Eimeriazurnii)、柱状艾美尔球虫(Eimeriacylindriac)、椭圆艾美尔球虫(Eimeriaellipsoidalli)、加拿大艾美尔球虫(Eimeriacanadensis)、皮利他艾美尔球虫(Eimeriapellita)；其中，牛艾美尔球虫和邱氏艾美尔球虫为优势虫种，其感染率分别为29.05%(52/179)、24.02%(43/179)；未发现等孢子属奶牛球虫。

A，邱氏艾美尔球虫；B，柱状艾美尔球虫； C，牛艾美尔球虫； D，加拿大艾美尔球虫；E，皮利他艾美耳球虫；F，椭圆艾美尔球虫。A， Eimeria zurnii; B， Eimeria cylindriac; C， Eimeria bovis; D， Eimeria canadensis; E， Eimeria pellita; F， Eimeria ellipsoidalis.图1 球虫孢子化卵囊显微镜观察图Fig.1 Observations of sporulated coccidia oocysts by microscope

2.2 奶牛球虫18S rRNA序列分析

2.2.1 PCR扩增结果

提取分离的奶牛球虫DNA，利用牛艾美尔球虫属18S rRNA序列通用引物进行PCR扩增。扩增出的18S rRNA片段大小为1 200 bp，与预期片段大小一致(图2)。

M，DL2000 DNA marker；1～8：奶牛球虫扩增产物。M， DL2000 DNA marker; 1-8， Amplified product of dairy coccidian.图2 奶牛球虫18S rRNA PCR扩增产物Fig.2 PCR amplification of 18S rRNA from dairy coccidia

2.2.2 奶牛球虫18S rRNA序列分析及其系统进化树

将奶牛球虫18S rRNA基因扩增产物进行测序，并将此测序结果与GenBank中已登录的牛艾美尔球虫(Eimeriabovis，AB769572.1)、邱氏艾美尔球虫(Eimeriazuernii，AB769655.1)、亚球形艾美尔球虫(Eimeriasubspherica，AB769641.1)、椭圆艾美尔球虫(Eimeriaellipsoidalis，AB769626.1)、加拿大艾美尔球虫(Eimeriacanadensis，AB769608.1)、阿拉巴艾美尔球虫(Eimeriaalabamensis，AB769555.1)、奥博艾美尔球虫(Eimeriaauburnensis，AB769557.1)、皮利他艾美尔球虫(Eimeriapellita，KU351731.1)、亚球艾美尔球虫(Eimeriasubspherical，AB769641.1)、阿氏艾美尔球虫(Eimeriaarloingi，MF356556.1)和柱状艾美尔球虫(Eimeriacylindrica，AB769618.1)的序列进行比对，并建立系统进化树。结果发现，宁夏地区分离的奶牛球虫与其他虫株亲缘关系较远，但本地虫株之间的亲缘关系较近。

图3 奶牛球虫18S rRNA基因序列的进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of bovine coccidia based on 18S rRNA gene sequence

3 结论与讨论

奶牛场引起犊牛腹泻的原因较多，包括细菌、病毒和寄生虫等，而寄生虫也较多，包括常见的球虫、隐孢子虫、贾第虫等[12]。奶牛球虫病主要发生于春、夏、秋季节，呈世界范围内分布，不同地区、不同牛群的球虫感染率和发病率有所差异，对养牛业的危害较为严重[6]。根据Koutny等[7]报道，澳大利亚被调查的牛场中有97.97%的牛场存在球虫感染，样品的阳性率为83.67%，共检出11种球虫。Bangoura等[13]对德国62个奶牛场进行奶牛球虫病流行病学研究发现，牛艾美尔球虫和邱氏艾美尔球虫的感染率分别为76.9%和83.1%。Asfaw等[3]对埃塞俄比亚东南部阿塞拉进行的犊牛球虫流行病学研究发现，其感染率为62.5%。Cardim等[5]调查巴西巴拉那州发现，其牛场球虫感染率为52.12%，共检查出10种球虫。曹希亮等[14]对北京、上海、山东、河南、四川和内蒙古6省市27个奶牛场进行奶牛球虫感染情况调查，发现牛场平均感染率为96%。李豪等[15]对我国宁夏、黑龙江、吉林省、辽宁、北京、天津、河北、广东8个省、市及自治区的43个奶牛场共534份粪样进行了球虫虫卵检测，发现39个奶牛场存在球虫感染，平均感染率为90.7%，各地区的样品阳性率为24.2%～37.2%，其中，宁夏的平均感染率为24.2%。李复煌等[16]调查北京地区30个奶牛场发现，其牛群平均感染率为23.88%，OPG值为549。郭志宏等[17]对放牧条件下青海省牦牛进行调查发现，该省牦牛共感染13种艾美尔球虫，其中牛艾美尔球虫、邱氏艾美尔球虫、椭圆艾美尔球虫、加拿大艾美尔球虫为主要虫种。张宽宽等[18]调查新疆库车县牛球虫感染情况发现，其感染率为40.82%，共发现8种球虫。本研究中，宁夏吴忠、石嘴山、贺兰地区5个不同规模化奶牛场均存在球虫感染的情况，平均感染率为56.98%，最大的OPG值为4 800，各奶牛场平均OPG值为1 358；其中牧场2的最高，平均OPG值为2 752；该结果明显高于前人研究的宁夏和其他省份的球虫感染率[19]，原因可能与本次调查采样全部来自腹泻犊牛的粪便有关，但各牛场OPG值与国内报道基本接近。本研究从阳性奶牛场中共查出6种艾美尔球虫，即牛艾美尔球虫、邱氏艾美尔球虫、柱状艾美尔球虫、椭圆艾美尔球虫、加拿大艾美尔球虫、皮利他艾美尔球虫，优势虫种为牛艾美尔球虫和邱氏艾美尔球虫。该结果与国内外奶牛、青海牦牛感染球虫的优势虫种存在部分交叉，说明牛艾美尔球虫和邱氏艾美尔球虫是大多数牛场致病的主要优势虫种，各牧场应给予足够的重视。

由于球虫孢子化卵囊壁比较坚固，球虫卵囊基因组DNA的提取方法不同于血液和细胞基因组的提取，在提取前需要破碎卵囊壁。目前，卵囊壁的破碎方法有多种，有玻璃珠法、超声波法和研磨器法等[11]。本试验采用传统的玻璃珠破碎法，通过PCR扩增结果发现，该提取方法既便捷又实用，并获得了较为理想的结果。18S rRNA作为DNA序列中最保守的一类，已被广泛应用于寄生虫分类鉴定和分子进化研究[20-21]。18S rRNA基因是由28S、18S、5.8S，以及被5.8S分隔的基因内转录间隔区ITS-1和ITS-2共同组成，内转录间隔区ITS-1和ITS-2作为非编码区，相对变化较大，较多用于种间鉴定[22]。本研究利用包括ITS-1和ITS-2非编码区的18S rRNA引物序列进行了扩增，电泳阳性结果均出现了单一扩增条带，片段大小约为1 200 bp，说明18S rRNA序列引物特异性较好；进而通过测定奶牛艾美尔球虫属18S rRNA的基因序列，构建系统进化树发现，宁夏地区所分离的奶牛球虫与其他虫株亲缘关系较远，但本地菌株之间有较近的亲缘关系，为确定其分类学地位奠定了理论基础。但本研究中所用的18S rRNA引物仅适合于牛艾美尔球虫属的扩增，无法鉴定到种。在后续工作中，可对各虫种18S rRNA序列差异片段设计引物，进行扩增，从而实现通过测序就能鉴定到种，以辅助临床虫种鉴定。