张丽 梁卓菲 张化为 黄文丽 宋小妹 宋蓓

(1.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学， 陕西 咸阳 712046；3.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712046)

肝纤维化是各种原因引起肝损伤后细胞的代偿反应，如长期无有效治疗，可进一步发展为肝硬化和肝癌。而肝纤维化被认为是一个动态的、可逆的过程，如果在这个阶段适当治疗，可以有效预防肝硬化和肝癌发生[1]。然而目前FDA尚没有批准任何一种治疗肝纤维化的药物，因此，寻求一种有效防治肝纤维化的中药成为一个迫切解决的问题。

珠子参PanaxjaponicusC．A．Mey．var．major(Burk．)C．Y．WuetK．M．Feng具有一定的保肝作用[2]。前期，本课题组对珠子参总皂苷进行的保肝作用研究表明，珠子参总皂苷对四氯化碳致大鼠急性或慢性肝损伤都有显著的保护作用，且无毒性反应[3]。本部分实验进一步对珠子参总皂苷预防肝纤维化作用进行研究，通过观察肝纤维化大鼠组织的病理变化，血清的各项生化指标的变化，探讨珠子参总皂苷对肝纤维化大鼠的预防保护作用，为珠子参总皂苷用于肝纤维化的防治提供一定的依据。

1 材料

1.1药品及试剂 珠子参总皂苷由本实验室(陕西中医药大学中药化学实验室)制备[4]，实验前取粉末适量，用0.5%的羧甲基纤维素溶解成混悬液；秋水仙碱，云南植物药业有限公司，以超纯水配制成所需浓度；四氯化碳，天津科密欧化学试剂有限公司，与橄榄油以1：1混合配制成50%CCl4溶液；天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、羟脯氨酸测定(HYP)试剂盒、透明质酸(HA)试剂盒、层粘连蛋白(LN)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2实验动物 SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体重 200±20 g，购于成都达硕实验动物中心，合格证号：SCXK(川) 2015-030。

1.3主要仪器及设备 病理冰冻切片机(德国LEICA公司)，低温高速离心机(美国BECKMAN公司)，酶标仪(美国BIO TEK公司)，激光扫描共聚焦显微镜(德国LEICA公司)，PTPS-2011彩色病理图文分析系统(重庆天海医疗设备有限公司)。

2 方法

2.1模型建立 取SD大鼠 48只，随机分为正常组(8只)、模型组(8只)、珠子参总皂苷(100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg)和秋水仙碱组(阳性对照组，0.1 mg/kg)，每组各8只。正常组腹腔注射同体积的橄榄油，剩余各组腹腔注射50%CCl4溶液，2次/w，连续8 w，注射量为2 mL/kg。正常组以外，剩余各组注射50% CCl4溶液2 w后，在各组大鼠饮水中加入含量为350 mg /L的苯巴比妥，从而增加大鼠肝脏对CCl4的敏感度。从造模第二周起，各给药组和阳性对照组大鼠灌胃给予相应的药物，而正常组和模型组灌胃给予相应量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，1次/d，连续7 w。

2.2样本采集与处理 末次给药第2 d，各组分别用20%氨基甲酸乙酯溶液(1.2 g /kg，ip) 麻醉大鼠，并分离腹腔主动脉，用10 mL无抗凝剂的离心管取血，3500 rpm 使其离心15 min，取血清保存于-20℃以备用。取肝脏，并称重，计算肝脏指数(g /g × 1000)；另取剩余部分肝组织-80℃保存。

2.3病理学观察 经4.0%多聚甲醛固定2 d的肝组织，脱水，包埋，切片(5 μm)，然后进行 HE和Massion染色，每张切片100 倍光镜下观察肝组织病理形态变化，并拍照。

2.4生化指标检测 按试剂盒说明书标示方法测定血清中ALT 、AST，ELISA 法检测SOD、GSH-Px、MDA、 LN、HA水平，酶标仪测定其 OD 值，制备标准曲线，采用双波长比色法，并计算大鼠血清中各指标含量。从-80 ℃冰箱中称取 50 mg肝组织，采用样本碱水解法测定HYP含量，检测时严格按照试剂盒说明书进行。

3 结果

3.1对大鼠肝脏指数影响 实验时给药前各组大鼠体重基本均一，然而在造模后，与正常组相比，模型组大鼠体重增长速度减慢，药物干预后各组大鼠体重虽有一定的改变，但无显著性差异；与正常组相比，模型组大鼠的肝脏指数显著升高(p<0.01)；与模型组相比，各剂量给药组大鼠肝脏指数的降低均具有显著性(p<0.01)，结果如表1所示。

表 1 对大鼠肝脏指数的影响

3.2对大鼠肝纤维化病理组织形态的影响 如图1所示为HE染色和Masson 的染色结果，正常组大鼠具有完整的肝小叶结构，以中央静脉为中心的肝细胞向四周成条索状排列，仅在中央静脉及肝窦周围出现极少量蓝色胶原纤维。而模型组大鼠肝细胞排列紊乱，周围炎性细胞浸润明显；纤维组织大量产生，自汇管区周围向外延伸，相互连接，形成假小叶结构；同时可见明显的脂肪性空泡。和模型组相比，珠子参总皂苷中、高剂量组肝组织病理损伤比模型组明显减少，而低剂量组肝组织纤维程度低，但比中、高剂量组明显，且仍伴有大量脂肪性空泡；高剂量组改善大鼠肝纤维化的作用优于阳性对照组。结果表明：珠子参总皂苷的所有给药组都使肝纤维化有不同程度的改善，纤维组织增生减少并且着色变浅，阳性对照组与高剂量组比较，以高剂量组最为明显。

3.3对大鼠血清ALT、AST的影响 当肝脏受损时，肝细胞发生坏死，ALT、AST大量释放入血中，血中转氨酶活性增高，因此ALT、AST是肝脏损伤的敏感标志。研究发现，与正常组相比，模型组大鼠血清 ALT、AST 水平显著升高，与模型组相比，给药组大鼠血清ALT、AST 水平显著降低，差异均具有显著性(p<0.01)。结果见表2

表 2 对大鼠血清ALT、AST的影响

3.4对大鼠肝组织HYP和血清HA、LN的影响 羟脯氨酸(hydroxyproline, HYP)为胶原组织的主要成分之一，透明质酸(hyaluronic acid, HA)和层粘连蛋白(laminin, LN)为细胞外基质主要成分，可较灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况[5]。与正常组相比，模型组大鼠肝组织 HYP、血清中HA和LN 含量显著升高(p<0.01)，而与模型组相比，给药组中、高剂量大鼠肝组织中HYP含量降低并且具有显著性(p<0.01)，各剂量组大鼠血清中HA和LN含量均显著降低(p<0.01)。结果见表3。

表 3 对大鼠肝组织HYP，血清HA和LN的影响

3.5对大鼠血清MDA、SOD和GSH-Px的影响 机体内脂质过氧化的程度常常由MDA 的量反映，可以间接地反映出肝细胞损伤的程度；SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞不受损伤，并反映机体抗氧化酶类活力；GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶[6]。与正常组相比，模型组 MDA 水平显著升高(p<0.01)，在给予药物干预后，与模型组相比，中、高剂量组MDA 水平显著降低(p<0.01)，低剂量组无显著差异；与正常组相比，模型组SOD和GSH-Px的水平显著降低(p<0.01)，各剂量给药组均使SOD和GSH-Px 的水平显著升高(p<0.01)。结果，见表4。

表 4 对大鼠血清MDA、SOD和GSH-Px的影响

4 讨论

病毒、药物的诱发和自身免疫性疾病等很多因素会导致肝损伤，肝损伤过程中凋亡和坏死的肝细胞以及其他非实质细胞会产生大量细胞因子和活性氧(ROS)，细胞因子和ROS能激活肝星状细胞，使其大量增殖[7-10]，导致细胞外基质过度聚集[11-14]，最终形成肝纤维化。本文结果表明，珠子参总皂苷对四氯化碳所致大鼠肝纤维化有显著的预防保护作用。

AST和ALT反映肝细胞的损伤程度[15]，给药组中大鼠血清中AST和ALT的表达水平显著降低，表明珠子参总皂苷有效的保护了损伤的肝细胞；HYP在肝纤维化的进程中随着胶原的增加或减少而发生变化，是评价胶原蛋白量与肝纤维化程度的重要指标[16]，给药组大鼠肝组织中HYP含量以及血清中HA和LN含量与模型组相比显著降低，表明珠子参总皂苷可能通过抑制纤维连接蛋白和胶原蛋白的过度表达，减轻肝纤维化的程度。CCl4经机体肝微粒体CYPs酶代谢可产生氯自由基，这些自由基可与细胞膜上的脂质发生脂质过氧化反应，导致氧化过程的终产物如MDA大量产生[17]。SOD为肝脏内最重要的抗氧化剂，在机体发生脂质过氧化反应时可有效清除体内的自由基[18]。GSH-Px可将氧化型谷胱甘肽(GSSH)还原为还原型谷胱甘肽(GSH)，增加机体的抗氧化能力[19-21]。由于CCl4诱导肝纤维化大鼠体内产生脂质过氧化反应，因而脂质过氧化产物MDA大量产生而显著性升高，SOD和GSH-Px这两种抗氧化酶被大量消耗而表现为显著性下降。珠子参总皂苷显著降低大鼠血清中的MDA的水平并且提高血清的抗氧化酶SOD、GSH-Px的水平，说明其能通过抑制脂质过氧化反应和自由基的产生来保护肝组织。

综上所述，珠子参总皂苷对大鼠肝纤维化具有一定的预防保护作用，可能通过抑制脂质过氧化、减少自由基生成、提高组织的抗氧化能力来发挥作用。本研究为珠子参总皂苷用于肝纤维化的防治提供一定的依据。