邓金生 邓明玉 方岱溶 何秋星

五色梅全草提取液活性物以黄酮为主，在化妆品中具有许多优良的性能。通过DPPH·抗氧化试验、MIC与抑菌圈抑菌试验及鸡胚尿囊膜血管试验（HEA CAM）等探究其功效性。研究结果表明五色梅全草提取液的IC50 为0.3842mg/ mL;对大肠艾希氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为125mg/mL、62.5mg/mL 和125mg/mL，其抑菌圈大小分别为10.58mm、 10.20mm 和9.80mm。HEA-CAM试验中1mg/mL的五色梅提取液的刺激性评分IS为4.98，表明该提取液具有轻度眼刺激性。本试验为五色梅全草提取液在化妆品中的应用提供依据。

五色梅（ Lantana camara L.）又名臭草、马缨丹，是马鞭草科马缨丹属植物。五色梅分布广泛，主要产于江西、浙江、湖南、广西、广东等地，以野生为主。研究资料显示[1]，五色梅植株中主要的非挥发性化学成分是萜类，此外，还包括黄酮、呋喃萘醌、苯乙醇苷和酚酸类化合物等。

郑达敏[2]等对五色梅进行系统的生药学研究，包括五色梅的显微结构、理化性质、性状等方面，为五色梅用药方面提供一定依据。韦贤[3]等发现五色梅总黄酮可能通过改善炎性组织液中TNF-a、IL-1β 及抗氧化水平机制，而对Ⅱ型胶原导致的大鼠关节炎症状进行有效改善。卢卫红[4]等分离得到五色梅叶片中的属青霉属（Penicilliumsp）的内生真菌，并且发现这种真菌的菌丝体发酵培养液能够抑制金黄色葡萄球菌。张伟[5]等对五色梅不同部位的总黄酮含量进行探究，发现五色梅的不同部位的总黄酮含量不同，且五色梅的乙醇提取液具有一定的抗氧化活性。由于五色梅具有多种生物活性，生长力旺盛，容易存活，廉价易得，具有良好的开发应用前景。

1. 实验部分

1.1原材料与仪器

实验所使用的五色梅购买于湖南省神农本草药业有限公司，实验所使用仪器见表1。

1.2. 五色梅全草提取液的功效评价

1.2.1 五色梅全草提取液的提取工艺

（1）五色梅的预处理：将干的五色梅全草在60℃的恒温干燥箱中干燥至恒重，经研磨粉碎后得到五色梅粉末，将粉末于室温下密封保存。

（2）提取：称取1g 五色梅粉末，加入乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，超声提取一段时间，趁热抽滤，定容至100 mL，备用。

1.2.2 DPPH 自由基清除试验

称取0.0039gDPPH，加65% 的乙醇溶解，定容备用;按照表2准确吸取Ac、Ai、Aj三组反应液于4mLEP管中。

混匀后，避光20min 进行反应，在波长517nm 处测吸光度，按式-1计算清除率S。

清除率（%）= （1-（Ai-Aj）/Ac）*100%（式-1）

以提取液浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图。线性拟合，根据拟合结果计算IC50

1.2.3 五色梅提取液的抑菌性能测试

①培菌与菌悬液制备

将铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌的菌种接种于普通琼脂斜面培养基，痤疮丙酸杆菌接种于脑一心浸液斜面培养基（BHI），用灭菌液体石蜡液封以达无氧环境，置于37℃C恒温培养箱中培养2～ 3天。

培菌完成后，用生理盐水 3mL 分别洗出斜面上的菌苔，充分摇匀，制成一定浓度的细菌悬液，置于4℃冷藏贮放备用。

②最低抑菌浓度（MIC）的测定

取1mL 浓缩到1g/mL 五色梅提取液（生藥量），加入到1mL 的液体培养基中，混合均匀，再从中吸取1mL稀释的提取液，加入到1mL的液体培养基中，以此类推，得到一系列不同浓度的五色梅提取液。

取0.1mL 含菌量约为108CFU/mL 大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的菌悬液接种于含抑（抗）菌剂的液体培养基的试管中，制备试验组样本，并设阴性对照管（卡松、培养基）、阳性对照管和纯培养基对照管（菌悬液、培养基）。

当阳性对照管有细菌混浊，阴性对照管无菌透明，试验组无菌生长的最高稀释度为该样品对受试菌的 MIC。

③抑菌圈实验法

目前，抑菌圈试验的方法主要有：杯碟法、Kirby- Bauer 法（以下简称K-B纸片扩散法）、平板打孔法等。 K-B 纸片扩散法可用于生长快速的细菌。因此，[前后没有必然因果联系，联系作者修改]绿脓杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈试验采用 K-B 纸片法。其操作方法如下：

倾注20mL 左右平板培养基于已灭菌的平板中，水平静置，等待凝固。在制备好的平板上接种0.1mL 菌悬液，涂布均匀后，将浸泡在lg（生药量）/mL 五色梅提取液的灭菌滤纸片取出，放到培养基中，轻轻按压，每个培养皿均匀放置3 张纸片，并且在同一个平皿中，放置1片浸泡65% 乙醇的纸片，充当溶剂对照。以浸泡生理盐水的纸片设置空白对照组，设置阳性对照是放置浸泡0.5%的卡松溶液的纸片。在37℃下，将培养基培养 18h，测定抑菌圈直径，其结果见表3。

1.2.4 鸡胚绒毛尿囊膜血管试验（HET-CAM）

参照《化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》（SN/T2329-2009） 进行，试验采用反应时间法。根据结果按式-1 计算刺激评分（IS）。

式2-6中：sec H为CAM首次出血的平均时间，单位是s（下同）;sec L为CAM出现血管融解的平均时间;sec C（凝血时间）是开始观察到CAM 出现凝血的平均时间。

2.结果与讨论

2.1 DPPH 自由基清除实验结果

五色梅总黄酮提取液的浓度对DPPH 自由基的清除率影响，结果见图1。

由图1可知，浓度在0.10mg/MI～0.60mg/mL 时，五色梅提取液对DPPH 的清除率随着五色梅浓度的增大而上升，且呈线性关系。其线性拟合方程为：y=1.5844x-0.1088，R2=0.99.38，由此可计算出五色梅的IC50为0.3842mg/mL。

2.2 抑菌实验结果

由表4可知，大肠艾希氏菌与表皮葡萄球菌的 MIC为125mg/mL，金黄色葡萄球菌的MIC为62.5mg/mL。说明相比于大肠杆菌和表皮葡萄球菌，五色梅提取液对金黄色葡萄球菌的抑制效果更强。1g/mL五色梅提取液（生药量）对大肠艾希氏菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌有一定的抑制作用。

2.3 刺激性实验结果

用浓度为1mg/mL、10mg/mL 的五色梅提取液采用反应时间法进行试验。如图2和表5所示，1mg/mL 五色梅提取液IS值为4.98，在1到5 之间，存在轻度的眼刺激性。10mg/mL 五色梅提取液IS 值为8.35，在5 到9 之间，存在中度的眼刺激性。

3.结论

本文通过DPPH自由基清除试验、MIC 试验、抑菌圈试验及鸡胚绒毛尿囊膜试验对五色梅全草提取液的功效进行了探究。

五色梅提取液的体外抗氧化性能测试表明其对DPPH自由基IC50 为0.38mg/mL;对大肠艾希氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌均具有抑制作用，其中，大肠艾希氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的MIC 分别为125mg/mL、62.5mg/mL及125mg/mL，其抑菌圈大小分别为10.58mm、10.20mm、9.80mm。HEA-CAM试验中1mg/mL 的五色梅提取液的刺激性评分IS 为4.98，表明该提取液有弱眼刺激性。

作者鄧金生和邓明玉供职于广州今盛美精细化工有限公司;方岱溶和何秋星供职于广东药科大学。

本项目受 2020年度省级大学生创新创业训练计划项目资助（项目编号： S202010573045）

参考文献

[1]余细红，向亚林.马缨丹的综合利用研究[J]. 亚热带植物科学，2012， 41（4）：83-87.

[2]郑达敏，周宁.中药五色梅的生药学研究[J].亚太传统医药，2012.8（04）：16-17[3]韦贤，王金妮，李振中，等.五色梅总黄酮治疗Ⅱ型胶原诱导大鼠关节炎及其机制[J]. 医药导报，2015，34（02）：189-192.

[4] 卢卫红，洗琼珍，朱峰.五色梅叶内生真菌YJ-11的分离鉴定及其抑菌活性[J].湖北农业科学，20l3，52（24）：6048-6050.

[5] 张伟，吴静姝，宋照风，等.五色梅总黄酮含量测定与自由基清除活性分析[J.湖北农业科学，2014，53（21）：5227-5230.