赵佳佳 木尼热·艾海提 张宇洁 杨俊玲 叶红霞 许 忠

乌鲁木齐市中医医院药学部，新疆乌鲁木齐 830000

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一种神经衰退性疾病，通常表现为运动迟缓，自主活动受限，集中体现在感觉、认知和睡眠障碍等方面[1]。此病通常发生在中脑黑质纹状体区域，主要是多巴胺缺失[2]，目前，发病原因和机制尚不清楚。临床西药治疗主要应用左旋多巴，使用该药后虽然能减轻患者的临床症状，但并不能从根源上阻止神经退化，且有较大的副作用[3]。近年来，中药及其复方制剂在治疗PD的神经保护方面开展了大量研究，并获得了成效[4-6]，已成为PD 防治药物开发的热点。

但是中医临床用药多是个人经验总结，虽然疗效显著，但对PD的治疗机制并不能明确解释。因此，本研究运用生物信息学分析，筛选出PD 关键致病基因和信号通路，同时预测潜在治疗中药，为PD的发生机制和中药治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 PD 差异表达基因的获取

通过GEO 数据库检索PD 患者和健康人的基因表达信息，运用GEO2R 分析PD 组和健康对照组间的基因差异，将P <0.05，FC>1 倍的基因纳入差异表达基因，在GeneCards 数据库，检索PD 相关基因，两个结果中共有基因为PD的显著差异基因。

1.2 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions，PPI）网络的构建

用PPI 网络分析基因或蛋白间的相互作用，通过String 数据库构建PPI 网络，将得到的PPI 信息导入Cytoscape 软件，得到PPI 网络图可视化。

1.3 靶点功能通路注释

经过GO 和KEGG 分析可知差异基因功能，进而分析其在疾病中的作用机制。将差异基因导入Metascape 数据库，选定物种为“homo sapiens”，校正名称，所有的名称都必须使用官方名称。设定阈值P ＜0.05，进行分析，并对富集分析结果进行可视化。

1.4 靶点-信号通路网络图

使用Cytoscape 软件，构建靶点-信号通路网络图，以展现通路的关键基因。

1.5 潜在治疗中药筛选

运用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）和Coremine Medical 信息检索平台，输入PD的关键基因，检索出与该基因相关的潜在治疗的中药和化合物。

1.6 靶点-化合物分子对接

从PBD 数据库中下载关键基因晶体结构，与活性化合物进行分子对接。

2 结果

2.1 差异表达基因筛选结果

按照筛选条件，得到基因表达谱系列（GSE22491）、（GSE54536），包括13例PD 患者和15 名健康对照标本，经GEO2R 分析，共获取1610 个差异基因，其中上调基因1159 个，下调基因451 个；与GeneCards 数据库中PD 相关基因取交集，最终筛选出576 个显著差异基因，包括上调基因428 个，下调基因148 个，绘制韦恩图和火山图，具体见图1。

图1 显著差异基因的韦恩图和火山图

2.2 靶点基因PPI 网络分析

在String 中输入428 个上调基因，148 个下调基因，得到PPI 网络图，其等级值由节点的大小来代表。显著上调基因：SRC、HSP90AA1、EGF、MMP9、FOS等；下调基因：TNF、CXCR4、CD19、FCGR2A、FCGR2B 等。见图2。

图2 靶点基因PPI 网络图

2.3 GO 富集和KEGG 通路分析

使用Metascape 对上调差异基因进行GO 富集和

KEGG 通路分析，得到P <0.05的GO 条目1515 个，生物过程（biological process，BP）条目1265 个，细胞组成（cellular component，CC）条目122 个，分子功能（molecular function，MF）条目128 个，部分显著条目见图3。KEGG 通路条目242 个，PI3K-Akt 信号通路得分最高，其次是MAPK 信号通路。见图4（封四）。

图3 GO 富集分析

使用Metascape 对下调差异基因进行GO 富集和KEGG 通路分析，得到P <0.05的GO 条目546 个，BP 条目452 个，MF 条目53 个，CC 条目41 个，部分显著条目见图3。KEGG 通路条目104 个，Tight junction信号通路得分最高，其次是Cancer、Neuroactive ligandreceptor interaction 信号通路。见图5（封四）。

2.4 靶点-信号通路网络图

利用Cytoscape 绘制通路网络图，圈代表通路，圈内代表靶点基因，形状越大代表富集越显著。上调核心基因：SRC、MAPK14、ABL1、PRKCB、HSP90AA1 等，下调核心基因：GRIN1、CHRNA7、NOS1、GRIN2D、BCL2等，具体见图6。

图6 靶点基因-信号通路图网络图

2.5 潜在治疗中药筛选

结合PPI 分析结果和靶点-信号通路网络图分析结果，主要显著基因有SRC、MAPK14、HSP90AA1、TNF、CXCR4、GRIN1。将其输入TCMSP、Coremine Medical中，超过4 个基因共同关联的中药有30 味，前三位为虎杖、雷公藤、沙棘，具体见表1。

表1 潜在治疗中药频数分布

2.6 靶点-化合物分子对接

将显著基因SRC、MAPK14、HSP90AA1、TNF、CXCR4、GRIN1 输入TCMSP、Coremine Medical 检索口服生物利用度最高的潜在化合物，并进行分子对接，结果见表2、图7。

图7 显著基因分子对接

表2 分子对接信息表

3 讨论

结合PPI 网络分析和靶点-信号通路网络图分析结果，主要显著基因SRC的基因产物c-SRC 在多种肿瘤细胞中可过度表达并高度激活，与MAPK 和PI3K/Akt 信号途径密切相关。HSP90AA1 参与细胞内蛋白质的合成与折叠，在保护细胞免受化疗、缺氧等应激损伤中发挥重要作用[7-8]。MAPK14 可促进炎症因子的调控激活，宿主细胞可通过蛋白抑制MAPK14 从而抑制病毒，并且与细胞分化、增殖、免疫调节密切相关[9]。TNF 参与细胞的凋亡、生长、炎症反应和免疫功能等[10]。CXCR4 趋化因子受体在急性炎症反应过程中通过快速募集到炎症部位参与构成急性炎症的第一道防线[11]。

KEGG 通路分析发现Neuroactive ligand-receptor interaction 信号通路，该通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关受体和配体的集合，其中受体基因Chrm3 上调会增强胆碱能功能，与促进学习和提高记忆能力有关[12]。Tight junctions 信号通路能紧密连接表皮细胞，防止机械损伤和体外有害物质入侵，调节水、电解质及炎症细胞的选择性渗透[13]。PI3K-Akt 信号通路参与细胞代谢、生存和死亡，该通路激活受阻与脑梗死、PD 等疾病的发生均密切相关[14]。使用PI3K 抑制剂wortmannin 可阻断PI3K/Akt 通路，解除p-GSK-3β，加重多巴胺神经元凋亡[15]。MAPK 信号通路可有效抑制神经元损伤和死亡[16-18]，是PD 类疾病发病的主要信号通路。

潜在治疗中药虎杖的药理实验显示[19-20]，其可有效抗菌抗病毒、扩张血管降低血压、抗血栓、抗炎镇痛及调节代谢等，在心血管方面疗效显著。虎杖中白藜芦醇及白藜芦醇脂质体对PD 模型大鼠黑质细胞具有明显的保护作用。潜在治疗中药雷公藤具有活血化瘀、杀虫消炎、降低血黏度、改善微循环等作用，并且雷公藤内酯对1-甲基-4-苯基-吡啶PD 大鼠模型具有神经保护作用[21]。潜在治疗中药沙棘具有祛痰止咳、消食化滞、活血散瘀的功效，能增强免疫，抗肿瘤，抑制血栓、改善心脑血管功能等。针对PD 患者不同程度的瘀血阻络，均可明显改善[22-23]。

化合物L-丝氨酸在细胞膜及神经细胞鞘形成等过程中发挥重要作用[24]。酪氨酸在甲状腺机能亢进等疾病治疗中有重要作用。雷公藤甲素具有抗老年性痴呆症作用，有效抑制Aβ 诱导的星形胶质细胞活化，减少细胞因子等炎症介质的释放，减轻Aβ 所致的大脑皮质胆碱能纤维损害，改善学习记忆能力[25]。咖啡因在治疗神经衰弱和昏迷复苏作用显著，有助于改善PD 患者的运动能力[26]。

综上所述，本研究从生物信息学角度系统分析了PD的病理机制和潜在治疗中药。通过SRC、MAPK14、TNF、CXCR4、GRIN1 等靶点作用，调控PI3K-Akt、MAPK、Tight junction 等信号通路来达到治疗目的，为PD的临床治疗提供参考依据。