朱忠敏

亚临界水提取灵芝酸性和中性三萜的工艺研究

朱忠敏

（福建仙芝楼生物科技有限公司，国家食用菌加工技术研发分中心，药用菌栽培与深加工国家地方联合工程研究中心，福州 350002）

为优化亚临界水提取灵芝酸性和中性三萜的工艺参数，采用正交试验方法，考察提取温度、压力、时间对提取结果的影响，以HPLC法测定灵芝酸性和中性三萜含量。结果表明，亚临界水提取灵芝三萜的优化条件为料液比1︰16，温度180 ℃，压力4 MPa，提取时间10 min。此条件下灵芝酸性三萜得率为1.132 mg/g，中性三萜得率为0.582 mg/g。结论：亚临界水提取灵芝酸性和中性三萜，较超临界CO2提取方法成本低，较传统的乙醇回流方法提取时间明显缩短，且不含有机溶剂，是一种于环境友好的产业化提取技术。

亚临界水提取；灵芝酸性和中性三萜；HPLC检测

灵芝（）为多孔菌科真菌，药用始载于《神农本草经》，至今有两千多年的历史，是中华人民共和国药典收载的法定中药材，其主要药用功能为“补气安神，止咳平喘。用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食”[1]。现代药理学研究证实，灵芝三萜是灵芝中的主要生物活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗菌抗病毒等多种功效[2-7]。

灵芝三萜可分为酸性三萜（灵芝酸）和中性三萜两大类，国内外研究多集中在灵芝酸性三萜，对于中性三萜研究较少，而实际上，中性三萜比酸性三萜具有更高的生物活性[8-9]，不仅能抑制增殖期的肿瘤细胞，而且能诱导休眠期肿瘤细胞的凋亡[10]。由于三萜化合物难溶于水，通常采用乙醇回流法、高压超临界CO2提取法及以乙醇为夹带剂的超临界CO2提取法提取灵芝三萜[11-15]。目前虽有报道亚临界水提取灵芝酸研究[16]，但关注亚临界水提取灵芝三萜的较少，我们采用正交试验方案，探索亚临界水同步提取灵芝酸性和中性三萜的优化工艺，以期为灵芝三萜的产业化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

灵芝颗粒（赤灵芝119，由福建仙芝楼生物科技有限公司提供，经福建农林大学菌物研究中心菌种鉴定）；灵芝三萜的对照品有灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C、灵芝酸C2、灵芝酸F、灵芝酸G、灵芝酸H、赤芝酸A、灵芝烯酸D和灵芝酮三醇等10个，由中国医学科学院药物研究所提供；甲醇（色谱级，广东光华）；乙腈（色谱级，广东光华）；冰醋酸（色谱级，广东光华）；超纯水（实验室自制，GWA-UN，北京普析通用）；乙醇（分析级，广东光华）等。

1.2 仪器设备

亚临界水提取装置（500 mL，中国林业科学院林产化学工业研究所定制设备）；液相色谱仪（LC-20A，日本岛津）；超声波清洗器（KQ-500，昆山超声仪器）；旋转蒸发仪（W2-100SP，上海申科）；色谱柱（LP-C18，4.6 mm´250 mm，5 µm，Welch）。

1.3 试验方法

1.3.1 灵芝原料的预处理

将赤灵芝原料粉粹、过筛，取40～60目细颗粒混合均匀，称取25.0 g共12份，其中9份按正交试验方案做亚临界水的提取实验，3份做最佳方案的验证实验；另外称取5.0 g二份，用于乙醇提取对比实验。提取获得的提取液，经过滤、浓缩、干燥，得提取物浸膏，作HPLC检测用。

1.3.2 亚临界水提取灵芝三萜的正交实验

9份25.0 g的灵芝原料，每份加水定容至400 mL（料液比1︰16），采用3因素3水平的L9(33)正交试验表进行试验。根据亚临界水提取的特点，将主要参数温度（℃）、压力（MPa）和时间（min）设置为3因素。由于灵芝的植物纤维含量高，在亚临界水提取温度超过250 ℃时，会出现焦味碳化现象，因此将温度因素的3个水平设置为不超过250 ℃，同时参照亚临界水提取特性，分别设置压力和时间的3水平（表1），以提取率（mg/g）为指标。

表1 亚临界水提取灵芝三萜因素和水平设计表

1.3.3 乙醇提取灵芝三萜的对比实验

二份5.0 g的灵芝颗粒原料，加入100 mL 95%乙醇（料液比1︰20），回流提取2 h，提取液经过滤、减压浓缩得提取物浸膏，做HPL检测用。

1.3.4 灵芝三萜检测

将1.3.1中得到的提取物浸膏，用95%乙醇超声溶解，置于4 ℃冰箱冷藏过夜；第二天，取上清液浓缩，定容后进行HPLC检测。由于酸性三萜和中性三萜的极性和最大紫外吸收波长有差异，采用不同HPLC检测方法，分别测定提取物中酸性三萜含量[9]和中性三萜含量[10-11]。方法如下：

（1）酸性三萜（灵芝酸）的HPLC检测采用HPLC测定，用一测多评法计算[17-19]。HPLC的条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相（4.6 mm´250 mm，5 µm）；以乙腈为流动相A，0.04%甲酸水为流动相B，按表2设置进行梯度洗脱；检测波长257 nm，柱温为30 ℃，流速1.0 mL/min。理论塔板数按灵芝酸A峰计算应不低于10 000。

表2 流动相运行梯度条件

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定，以一测多评法计算。对照品和供试品液相谱图见图1和图2。

根据所得的各对照品和供试品的峰面积，分别计算被测定供试品溶液中各种灵芝酸的含量，酸性三萜的含量以9种三萜的含量之和计。供试品中各灵芝酸含量以提取率W计，数值以mg/g表示，按公式（E.1）计算。

式中：—样品中各灵芝酸的提取率（mg/g）；—样品中各灵芝酸的峰面积；—对照品溶液灵芝酸A峰面积；—对照品溶液中灵芝酸A浓度（mg/mL）；—相对校正因子；—供试品溶液体积（mL）；—用于制备供试品溶液的灵芝原料重量（g）。

（2）中性三萜（灵芝醇、酮和醛等）的HPLC检测。目前，灵芝中性三萜的标准品稀少而昂贵，峰面积归一化法进行计算。我们参照文献[11]的

表3 相对校正因子表F

HPLC色谱条件进行分析，用峰面积归一化法进行计算。以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相（4.6 mm´250 mm，5 µm）；以甲醇为流动相A，0.5%乙酸水为流动相B，按表4设置进行梯度洗脱，检测波长243 nm，柱温为30 ℃，流速1.0 mL/min。理论塔板数按灵芝酮三醇峰计算应不低于10 000。

表4 流动相运行梯度条件

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，以峰面积归一化法计算。对照品和供试品液相谱图见图3和图4。

根据所得对照品和供试品的峰面积，分别计算出被测定供试品溶液中所有中性三萜类物质的含量，含量以提取率W计，数值以mg/g表示，按公式（E.2）计算。

式中：—样品内中性三萜类化合物的提取率（mg/g）；A—样品内中性三萜各峰面积总和；A—对照品溶液灵芝酮三醇峰面积；C—对照品溶液灵芝酮三醇浓度（mg/mL）；—供试校品溶液体积（mL）；—用于制备供试品溶液的灵芝原料重量（g）。

2 结果与分析

2.1 亚临界水提取灵芝酸性三萜正交试验结果

由表5可以看出，试验结果以A2B3C1组合方案的提取率最高，达1.038 mg/g。考虑到3因素3水平的组合共有81个，可能有其他组合方案提取率更高，按照“水平—提取率”的关系做进一步计算分析[20]。首先将A因素第1、2、3水平的提取率相加，分别记为K1a(M1+M2+M3)=0.783、K2a(M4+ M5+M6)=0.993、K3a(M7+M8+M9)=0.190。以此类推，可得到B因素3个水平的提取率加和K1b(M1+ M4+M7)=0.604、K2b(M4+M5+M6)=0.688、K3b (M3+M6+M9)=0.674，C因素3个水平的提取率加和K1c(M1+M4+M7) =0.686、K2c(M4+M5+M6)=0.648、K3c(M3+M5+M7)=0.632。然后，取各因素的水平提取率加和最大值K2a、K2b、K1c，组合成A2B2C1为最佳方案。这个最佳方案的提取率会不会比组合A2B3C1更好呢？将在下面作进一步实验验证。

1. 灵芝酸C2；2. 灵芝酸G；3. 灵芝酸B；4. 灵芝酸A；5. 灵芝酸H；6. 赤芝酸A；7. 灵芝烯酸D；8. 灵芝酸C；9. 灵芝酸F。

图2 亚临界水提取灵芝酸HPLC谱图

图3 灵芝酮三醇对照品HPLC谱图

图4 亚临界水提取灵芝中性三萜HPLC谱图

另一方面，计算各因素的极差R，即将该因素的K的最大值减去最小值。极差R越大的因素对提取率的影响越大，结果Ra的极差最大，得出温度是影响提取率的最重要因素，其次是压力，最小是时间。这与亚临界水的提取时间短、提取效率高，温度因素影响最显著的特征相吻合[20-25]。

表5 亚临界水提取灵芝酸性三萜的L9(33)正交试验结果

2.2 亚临界水提取灵芝中性三萜正交试验结果

对表6中的实验数据，采用表5的“水平—提取率”计算方法，获得各因素的不同水平提取率最大加和K2a=0.478、K2b=0.313、K3c=0.307，组合成A2B2C1（温度180 ℃，压力4 MPa，时间10 min）为最佳方案。这与提取酸性三萜的最佳方案一致。同时，极差R也是Ra最大，即温度对提取率影响最大，以下依次为压力和时间。

2.3 最佳方案的验证实验

按照上述得到最佳方案A2B2C1：料液比1︰16，温度180 ℃，压力4 MPa，时间10 min，重复试验3次，试验结果为灵芝酸得率1.132 mg/g，中性三萜化合物得率0.582 mg/g。

2.4 亚临界水提取与传统乙醇回流提取的比较

采用优化的亚临界水提取灵芝三萜方法与传统的乙醇回流提取法进行比较，以亚临界水提取的最佳设计方案（料液比1︰16，在180 ℃、4 MPa下提取10 min）得到的灵芝酸提取率为1.132 mg/g、中性三萜提取率为0.582 mg/g；而乙醇回流提取（料液比1︰20，80 ℃、常压下提取120 min）的提取率是灵芝酸1.185 mg/g，灵芝中性三萜0.606 mg/g。可见，亚临界水提取灵芝三萜的提取率基本与乙醇回流提取的相近，但提取时间大大缩短，仅为乙醇提取法的1/12，大幅降低了工业生产时间和能耗；且乙醇回流法乙醇成本较高，还潜存有机残留风险。

表6 亚临界水提取灵芝中性三萜的L9(33)正交试验结果

3 结 论

亚临界水提取技术由于其无溶剂残留、快速和节能等优点，现已在食品工业、中药和天然产物活性成分的提取[21-22, 24, 26-28]等方面获得了广泛的应用。本文通过正交试验，得到亚临界水提取灵芝酸性和中性三萜的优化工艺条件，其提取率与传统的乙醇回流法相近，但比后者更具绿色环保、省时节能、效率高等优点。与高压超临界CO2提取法或以乙醇为夹带剂的超临界CO2提取法相比，成本低且无有机溶剂残留，更适合应用于工业化生产，为灵芝三萜的提取应用提供一种新途径。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020,195-196.

[2] 刘维, 虎虓真, 朱莉, 等. 灵芝三萜的研究与应用进展[J]. 食品科学, 2019, 40 (5) : 309-315.

[3] 李国华, 李晔, 梅锡玲, 等. 灵芝三萜类化合物研究进展[J]. 中草药, 2015, 46 (12) : 1858-1862.

[4] 孙培龙, 陶文扬, 何晋浙, 等. 灵芝中三萜类化合物的研究进展[J]. 食药用菌, 2016, 24 (2) : 76-81.

[5] Smina T P, Nitha B, Devasagayam T P, et al.total Triterpenoidss induce apoptosis in MCF-7 cells and attenuate DMBA induced mammary and skin carcinomas in experimental animals[J]. Mutat. Res, 2017(1): 813.

[6] Li X, Xie Y, Yang B B. Characterizing novel anti-oncogenic triterpenoids from ganoderma[J]. Cell Cycle, 2018, 17 (5): 527-528.

[7] Ruan W, Lim A H, Huang L G, et al. Extraction optimisation and isolation of triterpenoids fromand their effect on human carcinoma cell growth[J]. Nat. Prod. Res, 2014, 28(24): 2264-2272.

[8] Li P, Liu L, Huang S, et al. Anti-cancer Effects of a neutral triterpenoids fraction fromand its active constituents on SW620 human colorectal cancer cells[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2020, 20 (2): 237-244.

[9] 唐庆九, 季哲, 郝瑞霞, 等. 灵芝中性三萜类成分的抗肿瘤作用[J], 食用菌学报, 2010, 17(1): 60-64.

[10] Dai J, Matthew A M, Nicholas J. Everetts, et al. Elimination of quiescent slow-cycling cells via reducing quiescence depth by natural compounds purified from[J]. Oncotarget, 2017, 8: 13770-13781.

[11] 南婷婷. 灵芝中性三萜组分的制备、质量控制及抗肿瘤活性的研究[D]. 福州: 福建医科大学硕士论文, 2015.

[12] Chen C, Li P, Li Y, et al. Anti-tumor effects and mechanisms ofextracts and spores oil[J]. ONCOLOGY LETTERS, 2016, 12: 3571-3578.

[13] 华正根, 王金亮, 朱丽萍, 等. 高压超临界CO2提取灵芝三萜和甾醇成分的研究[J]. 中国食用菌, 2018, 37 (5) : 62-65, 69.

[14] 章慧, 张劲松, 贾薇, 等. 超临界CO2萃取灵芝子实体三萜工艺优化及其与醇提法比较研究[J]. 食用菌学报, 2011, 18 (3): 74-78.

[15] 宋师花, 贾晓斌, 陈彦, 等. 超临界CO2萃取灵芝子实体中的三萜类成分[J]. 中国中药杂志, 2008, 33(17): 2014-2017.

[16] 徐瑞聆，郭思扬，王雅文, 等. 亚临界水提取灵芝子实体中灵芝酸类成分的优化[J]. 华西药学杂志, 2019, 34 (4): 393-395.

[17] T/CCCMHPIE1.49-2019. 植物提取物灵芝提取物（醇提）[S]. 中国: 中国医药保健品进出口商会, 2019.

[18] Liu W, Zhang J, Han W, et al. One single standard substance for the simultaneous determination of 17 Triterpenoidss inand its related species using high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr[J]. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2017, 1068 : 49-55.

[19] Da J, Cheng C R, Yao S, et al. A reproducible analytical system based on the multi-component analysis of Triterpenoids acids in[J]. Phytochemistry, 2015, 114: 146-154.

[20] 徐仲安, 王天保, 李常英, 等. 正交试验设计法简介[J]. 科技情报开发与经济, 2002, 19(5): 148-150.

[21] 张振巍, 李国庆, 仇继玺, 等. 亚临界提取技术在中药领域的发展及应用[J]. 中医学报, 2014, 29(197): 1494-1496.

[22] 郑光耀, 薄菜颖, 张景利. 亚临界水提取技术在植物提取物领域的应用研究进展[J]. 林产化学与工业, 2010, 30(5): 108-114.

[23] 吴其飞, 史嘉辰, 孙俊, 等. 农产品亚临界流体提取的理论研究现状与趋势[J]. 食品与机械, 2018, 34(7): 164-169.

[24] 蔡锦源, 王萌璇, 唐念, 等. 亚临界水提取技术及其在有效成分提取和分析领域中的应用[J]. 应用化工, 2017, 46(6): 1210-1213.

[25] 王荣春, 卢卫红, 马莺. 亚临界水的特性及其技术应用[J]. 食品工业科技, 2013, 34(8): 373-377.

[26] 郭娟, 丘泰球, 杨日福, 等. 亚临界水提取技术在天然产物提取中的研究进展[J]. 现代化工, 2007, 27(12): 19-24.

[27] 张晓菲. 亚临界水在食品中的应用及发展前景[J]. 分析检测, 2018, 1: 67-70.

[28] 李新莹, 刘兴利, 冯豫川, 等. 亚临界水提取在天然产物有效成分提取中的研究新进展[J]. 食品工业科技, 2012, 33(23): 414-418.

Study on acidic and neutral triterpenoids from Ganoderma lucidum by subcritical water extraction

Zhu Zhongmin

(Fujian Xianzhilou Biological Science ＆ Technology Co., Ltd; National R＆D Center For Edible Fungi Processing; Fujian Engineering Research Center for Medicinal Fungi; National and Local Joint Engineering Research Center for Cultivation and Deep Processing of Medicinal Fungi; Fuzhou, Fujian 350002, China)

In order to optimize the process parameters of acidic and neutral triterpenoids fromby subcritical water extraction (SWE).The effects of extraction temperature, pressure and time on the results were investigated by orthogonal test. The acidic and neutral triterpenoids ofwere determined by HPLC.The results showed thatthe optimum conditions of SWE extraction were: the solid-liquid ratio 1/16, tempereture 180 ℃,pressure 4 MPa, extraction time 10min. Under these conditions, the yield of acidic and neutral triterpenoids were 1.132 mg/g and 0.582 mg/g respectively. As an industrial extraction technology, the SWE is worthy for promotion, for its environmentally friendly, and compared with the supercritical CO2extraction, the SWE could reduce the costs. Compared with the traditional ethanol reflux method, the SWE could shorten the extraction time, and containing no organic solution.

subcritical water extraction; acidic and neutral triterpenoids from;HPLC

S567.3+1

B

2095-0934（2021）04-334-06

福州市市级科技计划项目—“一带一路”及对外科技合作项目（2019－S－107）