马莉莎 王嵘 柴丽霞

肺癌(lung cancer)是世界上发病率最高的癌症，患者5年生存率<15%，放疗是其重要治疗手段之一，患者后期产生的放射耐受是影响临床治疗效果的主要原因之一[1,2]。越来越多的研究证实，lncRNA(long non-coding RNA)和miRNA(micro RNA)在肺癌组织、细胞或体液中表达异常，通过EMT等途径参与肺癌的发生发展、放化疗耐受、预后及靶向治疗等[3-5]。报道显示，lncRNA VIM-AS1(VIM antisense RNA 1，VIM-AS1) 在前列腺癌和结直肠癌中高表达，下调其表达可抑制癌细胞的增殖等过程[6,7]。本研究通过startBase预测发现，miR-126-5p可能是VIM-AS1的靶基因。miR-126-5p在肺腺癌组织和患者外周血中含量降低，与患者预后有关[8]。细胞凋亡是放疗诱导肿瘤细胞死亡的主要机制，细胞凋亡的增加利于增强放疗敏感性[9]。而VIM-AS1和miR-126-5p在提高肺癌放射敏感性中的作用及相互关系目前尚不清楚。本课题主要研究lncRNA VIM-AS1对A549细胞放射敏感性的影响，以及miR-126-5p在其中的作用，为肺癌临床放疗敏感性研究提供新的数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 人正常肺上皮细胞BEAS-2B及人肺癌细胞A549、SPCA1和HCI-H596细胞购自中科院上海细胞库；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)、胰蛋白酶Trypsin购自Sigma-Aldrich公司；双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司；引物、miR-126-5p mimics(miR-126-5p)、miR-126-5p抑制剂(anti-miR-126-5p)、VIM-AS1干扰物(si-VIM-AS1)、空载体和对照物(miR-con、anti-NC和si-NC)及VIM-AS1突变型和野生型双荧光素酶载体购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂、Total RNA提取试剂盒、real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自宝生物工程(大连)有限公司；Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司；BCA蛋白试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将人正常肺上皮细胞BEAS-2B及人肺癌细胞A549、SPCA1和HCI-H596培养在含10% FBS的DMEM高糖培养液(添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)中，37℃ 5% CO2培养箱中培养，湿度95%，将细胞培养至对数生长期，消化传代。

1.2.2 细胞转染:收集对数生长期的A549细胞，用培养液将细胞稀释至1×106个/ml，以200 μl细胞/孔的密度接种于6孔板中，细胞培养至基本融合为一层时进行转染。根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染操作，将不同的载体转染入培养好的A549细胞中，培养6 h后换成DMEM高糖完全培养基，转染48 h后收集细胞进行实验。根据转染载体进行分组：si-NC组和si-VIM-AS1组、miR-con组和miR-126-5p组、si-VIM-AS1+anti-NC组和si-VIM-AS1+anti-miR-126-5p组。qRT-PCR检测VIM-AS1和miR-126-5p的表达收集培养好的BEAS-2B、A549、SPC A1和HCI-H596细胞，用试剂盒提取细胞总RNA，测定浓度和纯度，然后按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板按照 real-time PCR的说明书进行反应合成miR-126-5p和VIM-AS1，反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 15 s、55℃ 40 s、72℃ 30 s，35个循环，用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.3 克隆形成实验：测定放射处理后细胞存活分数收集转染后的对数生长期各组A549细胞，消化并计数，然后接种于6孔板，过夜培养。……