周银丽，熊 浪，陈永玲，彭梦林，杨 伟，胡先奇

（1.红河学院，a.云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室；b.商学院，云南 蒙自 661100；2.云南农业大学农业生物多样性与病害控制教育部重点实验室，昆明 650201）

间套作种植模式在中国有悠久的历史，适宜的间套作模式对缓解用地矛盾、增加土地产能、降低病虫害、维持土壤生态系统稳定性以及促进土地可持续利用具有重要作用［1］，可提高根际微生物多样性［2］，并且改善农田生态环境，促进生态平衡。高圣超等［3］通过研究不同大豆种植制度对土壤质量的影响表明大豆轮作、间套作有助于充分利用耕地资源，改善土壤理化性质，提高土壤酶活性更有利于维持土壤地力，提高土壤质量；国内外大量研究表明，合理间套作能够显著改善作物的矿质营养，从而促进作物生长、提高产量［4］。李章辉［5］通过研究花生连作田中土壤微生物群落得出随着花生连作年限的增加，土壤中真菌数量增加，细菌数量减少，证明连作使细菌型土壤向真菌型土壤转化。土壤微生物群落在不同的土壤、温度及水分条件下都有不同的成分构成。土壤微生物参与土壤腐殖质形成、有机质分解、养分转化和循环等过程，对土壤肥力形成及养分供应具有明显的调节作用［6］；同时，土壤养分也为土壤微生物提供生长环境及能量，使得土壤质量可通过微生物的变化而体现［7］。石榴是一种重要的经济果树，广泛用于食品、医用及有机合成，具有很高的经济价值。随着石榴种植规模的逐渐扩大，石榴病害日益严重，影响了石榴的产量，造成较严重的经济损失，研究表明石榴枯萎病的病原菌是甘薯长喙壳（Ceratocystis fimbriata）［8］。蒙自市发现石榴枯萎病的时间较早，相关的防治研究陆续在开展［9，10］，近年来石榴枯萎病在当地的危害逐年加重，是一种危害极为严重的毁灭性土传病害，很难防治，石榴枯萎病严重威胁着石榴产业的可持续发展。利用高通量测序的方法分析比较枯萎病石榴根际细菌与健康石榴根际细菌及间作桃树石榴园枯萎病土壤细菌多样性的差异，解析枯萎病石榴园间作桃树对改善土壤微生态平衡及其对多年生石榴果园连作障碍的修复作用。

1 材料与方法

1.1 石榴根际土样的采集

在云南省石榴主要栽培区的石榴园，分别选取石榴枯萎病根际土（MZD1、MZD2、MZD3）、健康石榴树根际土（MZ6、MZ7、MZ8）、间作桃树的石榴枯萎病土壤（MZP17、MZP18、MZP19）3种类型土壤，除去地表面土壤，采集根系周围1 cm左右的土为根际土，置于无菌自封袋中，将5棵同种果树根际土样混合作为一个样品，每种类型的石榴土壤样品均设3个重复，将土样置于冷藏箱中，及时带回实验室分析处理，首先进行去杂和过筛处理，用于土壤基因组DNA提取的土壤样品，置于1.5 mL的离心管装好，-80℃冰箱保存。

1.2 土壤基因组DNA提取方法

用土壤基因组DNA提取OMEGA试剂盒，参照步骤进行，提取好的DNA放在-20℃冰箱保存。

2 结果与分析

2.1 3种类型样品根际土壤细菌的OTU分析及物种注释

3种样品MZD、MZ、MZP在界水平上的平均序列数目分别为33 160、14 742、15 426；MZD、MZ、MZP在门水平上的平均序列数目分别为33 099、14 729、15 419；MZD、MZ、MZP在纲水平上的平均序列数目分别为32 779、14 631、15 362；MZD、MZ、MZP在目水平上的平均序列数目分别为26 781、12 743、13 634；MZD、MZ、MZP在科水平上的平均序列数目分别为15 953、8 554、9 607；MZD、MZ、MZP在属水平上的平均序列数目分别为5 884、3 661、4 497；MZD、MZ、MZP在种水平上的平均序列数目分别为1 443、970、850，物种序列构成柱状见图1。

图1 每个样品细菌在各分类水平上的序列构成

按所有样品间序列最小值对OTUs聚类结果进行标准化处理，根据OTUs聚类分析结果和研究需求，分析不同样品之间OTUs的共有、特有信息绘制韦恩图（Venn Graph），结果见图2。在图2中比较了3种不同土壤样品中OTUs的信息，MZD、MZ、MZP的OTUs数分别为1 727、1 662、1 510，MZD、MZ、MZP共 有 的OTUs有1 246，MZD特 有OTUs数 为159，MZ特有OTUs数为46，MZP特有OTUs数为54。

图2 三种类型土壤样品细菌多样性

2.2 3种类型样品根际土壤细菌微生物多样性统计及物种丰度聚类

2.2.1 门水平上3种类型样品根际土壤细菌多样性 门水平上3种类型样品根际土壤细菌多样性见图3。MZP18中BRC1、AD3、酸杆菌门（Acidobacteria）相对丰度较高，绿弯菌门（Chloroflexi）、WS3、装甲菌门（Armatimonadetes）相对丰度较低；MZ7中迷踪菌门（Elusimicrobia）、OD1、GAL15相对丰度较高，装甲菌门、绿菌门（Chlorobi）、绿弯菌门相对丰度较低；MZ6中TM6、泉古菌门（Crenarchaeota）、绿弯菌门相对丰度较高，浮霉菌门（Planctomycetes）、酸杆菌门、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）相对丰度较低；MZP19中拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝藻门（Cyanobacteria）、绿菌门相对丰度较高，AD3、厚壁菌门（Firmicutes）、WS3相对丰度较低；MZD1中装甲菌门、TM6、纤维杆菌门（Fibrobacteres）相对丰度较高，泉古菌门、AD3、广古菌门（Euryarchaeota）相对丰度较低；MZ8中浮霉菌门、TM7、Thermi相对丰度较高，TM6、迷踪菌门、OD1相对丰度较低；MZP17中疣微菌门（Verrucomicrobia）、放线菌门（Actinobacteria）、AD3相对丰度较高，浮霉菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）相对丰度较低；MZD3中酸杆菌门、厚壁菌门（Firmicutes）、WS3相对丰度较高，放线菌门、变形菌门（Proteobacteria）、泉古菌门相对丰度较低；MZD2中广古菌门（Euryarchaeota）、NC10、GNO4相对丰度较高，拟杆菌门、疣微菌门、AD3相对丰度较低。

图3 门水平上3种类型样品根际土壤细菌的物种丰度聚类

2.2.2 属水平上3种类型样品根际土壤细菌多样性 如表1所示，在属的分类水平上，3种类型土壤的细菌在一定程度上存在着数量上的显著差异性，枯萎病石榴根际细菌与栽种桃树修复枯萎病石榴土壤根际细菌存在显著差异的属有蓖麻杆菌属（Kaistobacter）、红游动菌属（Rhodoplanes）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）、新鞘脂菌属（Novosphingobium）、地嗜皮菌属（Geodermatophilus）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）、戴 沃 斯 菌 属（Devosia）、苯 基 杆 菌 属（Phenylobacterium）、放线孢菌属（Actinomycetospora）、丰祐菌属（Opitutus）、无色杆菌属（Achromobacter）、肠球菌属（Enterococcus）、纤维菌属（Cellulosimicrobium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、柄杆菌属（Caulobacter）、诺卡氏菌属（Nocardia）等。栽种桃树修复石榴枯萎病土壤根际与健康石榴根际土壤细菌存在显著差异的属有假诺卡氏菌属、苯基杆菌属、放线孢菌属、无色杆菌属、链球菌属、柄杆菌属、糖单孢菌属、诺卡氏菌属等。

表1 属水平上3种类型样品根际土壤细菌多样性的部分统计分析

2.3 3种类型土壤样品的根际细菌多样性的PCA比较

对3种类型土壤样品的根际细菌多样性进行PCA［11］（Principal Component Analysis，PCA）分析，结果见图4，第一主成分对样品差异的贡献值为33.92%，第二主成分对样品差异的贡献值为19.79%。间作桃树的石榴枯萎病土壤（MZP）的细菌群落组成较相似，距离较近，基本聚在一起；蒙自石榴园的健康石榴根际土壤样品（MZ）与间作桃树的石榴枯萎病土壤（MZP）的细菌群落组成也较相似，距离相对较近，基本聚在一起；来自蒙自市石榴园的枯萎病石榴根际土壤样品MZD1与MZD2、MZD3的距离相对较远，群落组成差异相对较大，可能与采样地域跨度较大有关。间作桃树的石榴枯萎病根际土壤（MZP）的细菌群落组成与枯萎病石榴根际土壤样品（MZD）的细菌群落组成差异较大。

图4 3种类型土壤样品细菌的PCA分析

3 讨论

利用16S rDNA测序法研究土壤根际细菌多样性的报道较多。杨广容等［12］基于16S rDNA测序法对茶园土壤细菌群落多样性的研究，表明古茶园土壤细菌的丰度和多样性高于现代茶园及森林，徐丽霞等［13］研究了玉米根际土壤（RS）与非根际土壤（NRS）土壤细菌多样性的差异，同时利用细菌16S rDNA测序法研究健康及病害植物土壤根际细菌多样性差异的报道也较多。邓晓等［14］研究了3个典型香蕉枯萎病患病样地的健康植株根区土壤和患病植株根区土壤细菌遗传基因多样性，从微生物生态学的角度解释香蕉枯萎病的发生原因并为其防控提供理论依据。马云艳等［15］研究表明辣椒病株根区土中的微生物数量较健康植株发生较大变化，其中真菌数量增加388.9%，辣椒病株与健康植株根区土中微生物数量异常，种类变化是辣椒疫病发生的重要原因之一。研究表明，间作桃树的石榴枯萎病土壤与石榴枯萎病石榴根际土壤细菌多样性在属的分类水平上，两种类型土壤有16属的细菌差异显著，说明通过间作桃树可以改变枯萎病石榴根际的细菌多样性，进而改善土壤微生态平衡，促进石榴健康生长。

4 小结

用高通量测序的方法研究了云南省蒙自市石榴园根际细菌的多样性，通过对石榴枯萎病根际土、健康石榴树根际土、栽种桃树修复枯萎病土壤3种类型样品根际土壤细菌多样性进行物种注释，探索间作桃树对石榴园枯萎病土壤根际细菌多样性的影响。结果表明，MZD、MZ、MZP得到的OTUS数分别为1 727、1 662、1 510。PCA分析结果表明，间作桃树修复石榴枯萎病根际土壤的细菌群落组成与枯萎病石榴根际土壤样品的细菌群落组成差异较大，间作桃树能较大程度改变枯萎病石榴根际土壤细菌的群落组成。在属的分类水平上，栽种桃树修复枯萎病土壤与健康石榴根际土壤细菌多样性显著差异的属有假诺卡氏菌属、苯基杆菌属、放线孢菌属等8种。栽种桃树修复枯萎病土壤与枯萎病石榴根际土壤细菌存在显著差异的细菌属有链球菌属、纤维菌属、放线孢菌属、蓖麻杆菌属、红游动菌属、假诺卡氏菌属等16种。这些属在两种根际土壤中的差异显著，说明在石榴枯萎病发生园区间作桃树改变了枯萎病石榴根际的细菌多样性，改善土壤微生态平衡，对利用间作桃树控制石榴枯萎病的发生及扩散提供了一定的参考。