耿迎雪 ,李曼焘,曹 妍 ,赵 群 ,李英杰 ,刘 丹 ,师伟萌 (.昆明理工大学环境科学与工程学院,云南 昆明 650500；2.西昌学院土木与水利工程学院,四川 西昌 6503；3.昆明理工大学国土资源工程学院,云南 昆明 650093)

多环芳烃(PAHs)在大气环境中广泛存在[1−2],其可随细颗粒经呼吸作用到达肺泡[3−6],在肺泡的气体交换界面与肺表面活性物质(PS)接触,PS是抵御PAHs进入人体血液循环的最后一道屏障[7−9].PS位于肺泡液膜最外层,是由肺泡 II型上皮细胞合成和分泌的具有特殊生物活性的复合物,能有效降低肺泡表面张力、防止肺泡在呼气最后阶段发生塌陷[10−12].1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)和 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)是PS中重要活性组分,对PS生理功能的发挥起关键作用[13−14].在呼吸循环过程中,PS膜进行周期性的压缩−扩张循环,并伴有气相(G)−液态扩张相(LE)−液态凝聚相(LC)的规律性相转变[15].DPPC是生理温度下唯一能形成LC相的组分,是降低肺泡表面张力最主要的物质[16],POPC能增强膜分子的流动,促进PS自发扩散及 LE相的形成[17−18],同时二者的比值对PS的空间构型及界面行为有重要影响[19].不同哺乳动物含有大致相似的磷脂组成,在天然 PS中POPC是主要不饱和组分之一,研究表明小鼠肺内DPPC与POPC摩尔占比约为4:1,新生小牛肺PS中DPPC与POPC分别占磷脂酰胆碱(PC)总量的(41.1±1.5)%、(14.3±0.6)%[16,19−21],这一比例关系会随生理状态的改变而变化.在胚胎发育过程中,随着胎儿肺的成熟DPPC含量增加,POPC含量短期下降;患有囊性纤维性疾病及急性呼吸窘迫综合征的儿童,肺内DPPC浓度均会随疾病的发展逐步减少,而POPC含量升高[14,22−23].DPPC与POPC的比例关系与肺的顺应性及阻力有关,在一定程度上体现了不同生理状态下PS的活性.

PAHs与PS接触会发生一系列的界面化学反应.分子动力学模拟发现PAHs会与磷脂疏水酰基链结合并对磷脂分子产生亲和作用,这说明 PAHs会在PS单层累积并影响磷脂分子的构象[24−25].但由于分子动力学模拟局限于小体系研究,PAHs对 PS膜宏观结构以及物理化学性质的影响尚不清楚.本文前期研究中发现PS能使吸附在纳米SiO2表面的PAHs析出,析出量与 PAHs疏水性呈正相关[26],这意味着PAHs随细颗粒在PS膜累积后会进一步反应,PS膜可能不是阻碍PAHs迁移的有效屏障.同时在不同的生理状态尤其是肺部疾病下PS组分会发生变化,这是否会削弱PS膜的防御能力造成PAHs潜在毒性的加剧鲜有报道,值得深入探究.

PAHs与 PS的作用关系十分复杂,由于实验周期、伦理方面等原因进行体内原位监测难以实现.本文以DPPC/POPC混合磷脂为PS模型,采用体外模拟法研究苯并[a]蒽与DPPC/POPC混合磷脂的相互作用,通过 Langmuir−Wilhelmy(L−W)膜天平模拟呼吸过程苯并[a]蒽对PS膜相行为的影响,结合弹性模量分析PS膜抗形变能力的变化,利用布儒斯特角显微镜(BAM)观测苯并[a]蒽存在下 PS膜微观形貌的改变,随后通过苯并[a]蒽溶出实验、磷脂胶束粒度分析及透射电镜表征进一步探究DPPC/POPC混合磷脂与苯并[a]蒽的作用机制.苯并[a]蒽与肺表面活性物质混合磷脂膜间的界面化学作用,有利于苯并[a]蒽健康危害机制的阐释,也有利于解释其他污染物联合暴露的健康影响,为空气污染物肺健康风险评估提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

DPPC(纯度≥99%)、POPC(纯度≥99%)购自Sigma 公司;苯并[a]蒽(纯度≥98%)购自百灵威科学有限公司;氯仿、无水乙醇、氯化钠均为分析纯,购自成都市科龙化工试剂厂;实验用水均为超纯水,其室温下的电阻率为18.25MΩ·cm.

1.2 实验设备

多功能 L−W 膜天平(JML04C2,上海中晨数字技术设备有限公司);布儒斯特角显微镜(Nanofilm−EP4BAM,Accurion GmbH,德国);马尔文纳米粒度分析仪(Zetasizer Nano ZS90,Malvern,英国);场发射透射电镜(日立 HT7700,日本);紫外可见分光光度计(Evolution 220,Thermo Scientific,美国).

1.3 实验方法

1.3.1 表面压−面积等温线(π−A 等温线)的测定DPPC、POPC分别溶于氯仿,按不同比例混合,制备1.0mmol/L的混合膜液(POPC比例 XPOPC=0,0.4,0.6,1.0),同时在每组膜液中加入适量苯并[a]蒽使磷脂总量与苯并[a]蒽的摩尔比为 8:1.配制 0.9%的氯化钠溶液为实验的亚相,通过L−W膜天平测量苯并[a]蒽对混合磷脂膜π−A等温线的影响[27].通过水浴恒温装置控制实验温度为(37±0.5) ℃.每组实验测量3次以确保其重现性.

1.3.2 BAM 测定 借助 BAM 可对苯并[a]蒽存在下混合磷脂膜的微观形貌进行观测[28−29].将适量的亚相溶液加入聚四氟乙烯液槽中,在气−液界面滴加适量的磷脂膜液,待氯仿挥发完毕,对磷脂膜的微观形貌进行图像捕捉.在呼吸循环过程中,肺泡内PS膜会在35～40mN/m的压力下受到周期性扰动[13,16],为接近真实的生物膜状态,本实验选取 π=35mN/m 为实验膜压.

1.3.3 DPPC/POPC混合磷脂对苯并[a]蒽的增溶作用 制备浓度为200mg/L的DPPC、POPC水溶液,二者以不同比例混合制备DPPC/POPC混合溶液,并稀释成一系列的浓度梯度.向20mL具有不同浓度的混合磷脂溶液中加入等量的苯并[a]蒽.在恒温摇床中以 120r/min的速度振荡 24h,温度控制为(37±0.5)℃.反应结束后静置 2h,将样品以 3000r/min的转速离心 30min以分离出未溶解的苯并[a]蒽粉末.取上清液,用正己烷萃取后在287nm处用紫外/可见分光光度计测吸光度.

1.3.4 DPPC/POPC混合磷脂胶束粒径及形态测定制备浓度为200mg/L的DPPC、POPC溶液,二者以不同比例混合制备DPPC/POPC混合溶液,测其粒径及粒径分散性指数(PDI).另取样品悬液滴在干燥的封口膜上,把铜网放在悬浮液中漂浮2min,用滤纸吸干铜网上的多余悬液,然后磷钨酸染色1～2min,用滤纸将染液吸干,在透射电镜下观察磷脂胶束的形态,加速电压为80kV.

1.4 数据处理

所有实验数据均采用 Origin2016和 Microsoft Power Point软件处理并作图,采用SPSS 23.0对数据进行统计分析,P<0.05表示差异显著.

2 结果与讨论

2.1 苯并[a]蒽对 DPPC/POPC混合磷脂膜 π−A等温线的影响

π−A等温线是体外研究呼吸过程 PS膜的重要手段,通过对滑障压缩过程磷脂分子间表面压力的实时监测,可获取压缩−扩张循环PS膜的相变节点、最大表面压(πmax)等重要界面特征参数[30−31].由图 1可知,不同实验组 π−A等温线呈现相似的特征:扩张曲线在压缩曲线的下方,近似呈封闭、两端尖的长梭形状.不同的是随POPC含量增加,膜的相态改变,纯组分DPPC单分子膜主要表现为LE相和LC相;在相同表面压力下POPC向较高的单分子面积区域移动,在压缩阶段大都以LE相存在;而DPPC/POPC混合组分介于单组分之间并出现明显的 LE−LC共存平台,如单分子面积A=80Å2时,DPPC膜和POPC膜的表面压力分别为 15.47和 35.12mN/m,混合组分DPPC/POPC(XPOPC=0.4)的表面压力介于纯组分之间,为 20.63mN/m.同时 POPC 占比增多会使πmax降低,由 DPPC膜的 58.17mN/m降至 POPC膜的44.56mN/m.由于πmax代表磷脂膜崩解前能承受的最大表面压力[14],这表明 POPC会使混合膜的界面稳定性减弱.

图1 苯并[a]蒽对DPPC/POPC混合磷脂单分子膜π−A等温线的影响Fig.1 Effect of benz[a]anthracene on surface pressure−area isotherms of mixed DPPC/POPC monolayers

加入苯并[a]蒽,每组滞回曲线的形状未发生变化,但均出现滞后效应且滞回面积增加.苯并[a]蒽对磷脂膜相变的影响可能和它的亲脂性有关.滞回曲线的变化过程与膜分子的流动性和排列组装有关,相变的滞后说明苯并[a]蒽对磷脂分子的有序排列产生影响.Lilland等[32]在研究PAHs与磷脂双层的作用时发现,菲(3环)和苯并[a]芘(5环)对磷脂双层具有亲和力,会改变磷脂的相变温度,同时较大尺寸的PAHs对膜分子的有序排列影响更大,会插入酰基链之间或取代脂分子.苯并[a]蒽作为一种 4环结构的PAHs具有较强的亲脂性(logkow=5.910)[33],会与DPPC、POPC的酰基链结合使磷脂分子的自组装及再扩散受阻,并导致相变的延后.另一方面,滞回面积反映了单分子膜的能量耗散,能量耗散越大则所需的呼吸功越多,这意味着苯并[a]蒽会使呼吸过程尤其是呼气过程的呼吸功增加,对肺通气的顺应性产生不利影响,而 POPC由于一个不饱和键的存在可能和苯并[a]蒽的结合力更强,会使苯并[a]蒽的负面效应进一步扩大.

2.2 苯并[a]蒽对 DPPC/POPC混合磷脂膜弹性模量的影响

弹性模量(Cs-1)是表征单层膜物理状态的重要参数,反映了膜的抗形变能力,值越大表明膜的刚性越强.Cs-1可由公式(1)计算得出:

式中:π表示单分子膜的表面压力,mN/m;A表示单分子面积,Å2;T 表示温度,℃[34−35].如图 2 所示,在压缩−扩张2阶段,不同实验组Cs-1值均呈现先增大后减小的趋势.纯组分 DPPC单层膜的 Cs-1值高达122.4mN/m,说明在对抗外界压力下,DPPC膜体现出较好的刚性及稳定性.POPC的加入导致Cs-1最大值降低至 72.06mN/m,大小顺序依次为 Cs-1(DPPC)>Cs-1(DPPC/POPC)>POPC,同时在 35～50mN/m 时曲线出现“凹槽”,表明LE相到LC相的相变发生.这可能是由于POPC分子扩散到DPPC分子之间,造成磷脂分子的重新排列并出现相的分离.加入苯并[a]蒽,Cs-1值呈现出类似的变化趋势,并均在 π=40mN/m 附近出现最大值,不同的是在压缩阶段,苯并[a]蒽存在下每个实验组的 Cs-1最大值均不同程度下降,纯组分DPPC单分子膜的Cs-1最大值由122.4mN/m降低至81.7mN/m.随着POPC含量的增加,苯并[a]蒽对混合磷脂膜的扰动更大,Cs-1值变化明显,尤其是磷脂膜的前期扩张阶段.上述结果说明苯并[a]蒽会削弱混合磷脂膜的抗形变能力,这一不利影响随 POPC含量的增多会进一步扩大至膜的前期扩张阶段.

图2 苯并[a]蒽对DPPC/POPC混合磷脂膜弹性模量的影响Fig.2 The elastic modulus Cs-1 vs.surface pressure (π) dependencies for mixed DPPC/POPC monolayers with/without benz[a]anthracene

2.3 苯并[a]蒽对 DPPC/POPC 混合磷脂膜微观形貌的影响

BAM 技术依据表面膜在不同相区时折光指数不同而有不同的反射强度,能提供磷脂单层横向结构的详细信息.进一步探究苯并[a]蒽与磷脂分子的作用细节,借助BAM对磷脂膜的微观形貌进行动态捕捉.观察图 3可发现,不同实验组的磷脂膜微观形貌不同.纯DPPC膜在π=35mN/m的膜压下形成液晶畴,表现为均一连续的 LC相,与前人的研究结果一致[36],XPOPC=0.4,磷脂分子均匀分布,以 LC 相为主体、部分区域出现相的分离,这说明 XPOPC=0.4时DPPC与 POPC接近理想混合,XPOPC=0.6,磷脂分子的聚集程度减弱,有磷脂胶束形成,胶束大多呈梅花形,纯组分 POPC膜呈现明显流态化,以 LE相存,所得结果与上述 π−A等温线的分析相吻合.DPPC、POPC以不同比例混合形成的膜相态不同,与二者酰基链的构型有关.DPPC两条饱和酰基链被压缩后成直线排列,而POPC酰基链呈弯曲形状,这会使POPC分子相互靠近变得困难、流动性增加,不能在界面形成致密有序的LC相[37−38].

苯并[a]蒽加入后,膜的形貌发生改变.由图3(e)、图 3(f)可知,苯并[a]蒽会嵌入膜分子之间并干扰其有序排列;由图 3(g)可见,苯并[a]蒽会与磷脂胶束结合并形成复合体;对于 POPC膜则会引起界面成膜分子的数量明显减少(图3(h)).这说明磷脂分子在苯并[a]蒽的亲和作用下有序度降低,而 POPC可能与苯并[a]蒽的结合力更强,在这种约束作用下有更多的 POPC分子不能在界面自由移动.这一结果再次表明:苯并[a]蒽会影响磷脂分子的排列结构及成膜过程,苯并[a]蒽的作用行为会因DPPC、POPC相对含量的不同具有差异性.另一方面,苯并[a]蒽与磷脂分子的亲合作用可能对苯并[a]蒽的溶解迁移造成影响.由于在较高的表面压力下,磷脂膜会发生崩解并伴有部分膜分子进入到水相,苯并[a]蒽极有可能在胶束的“拉扯”作用下一同被挤压到水溶液中,若DPPC/POPC磷脂胶束具有常规表面活性剂的增溶性能,则会导致苯并[a]蒽的溶出量增多、潜在毒性加剧.

图3 苯并[a]蒽对DPPC/POPC混合磷脂膜原位微观形貌的影响Fig.3 Effect of benz[a]anthracene on morphology of mixed DPPC/POPC monolayers

2.4 DPPC/POPC混合磷脂对苯并[a]蒽的增溶作用

为考察DPPC/POPC混合磷脂对苯并[a]蒽的增溶效果,通过公式(2)[39]进行定量计算.

式中:Sw*是 PAHs在表面活性剂溶液中的表观溶解度,mg/L;Sw是PAHs在37℃水中的初始溶解度, mg/L.由图 4(a)可见,DPPC 能促进苯并[a]蒽的溶出,表观溶解度随DPPC浓度的增加而变大,当CDPPC= 200mg/L时,苯并[a]蒽的表观溶解度为 1.152mg/L,接近水溶液的3倍,增溶效果较好.由图4(b)可知,DPPC/POPC混合组分同样对苯并[a]蒽具有较好的增溶作用,并随POPC占比的增加效果越明显,当磷脂总浓度 C=100mg/L时,各组的增溶能力依次为:DPPC

图4 DPPC/POPC混合磷脂对苯并[a]蒽的增溶作用Fig.4 Solubilization of benz[a]anthracene by mixed DPPC/POPC phospholipids

由表1及图5可知,不同组分的磷脂形成的胶束形态不同,POPC含量增多会使胶束的平均粒径变小、分散性指数 PDI降低,随 POPC含量增加 PDI依次为:0.494>0.405>0.348>0.178.结合图 6透射电镜结果可见,胶束的形状也会发生改变.DPPC胶束形状不规则,有层状、球状及 DPPC游离分子出现,双组分磷脂胶束形状趋于规则同时聚集数降低,而POPC胶束以球形为主,这说明POPC比DPPC的分散性更好.POPC由于不饱和键的存在,分子间的间距较大,这会造成 POPC更低的疏水性以及更强的流动性[40−41],PAHs可能更易渗透到POPC的疏水区,导致在水溶液的分配量增加,这可能是二者增溶能力差异的主要原因.这一结果表明,对于特殊工作环境的人员如长期暴露于交通污染的环卫人员、焦化厂从事一线作业的职工等,由PAHs暴露导致的患病风险极高.对于不同生长阶段或处于不同生理状态的人群更是具有特别重要的意义,由于生理条件改变引起PS组分的变化可能造成PAHs潜在毒性的差异,PAHs对患有相关肺部疾病的人群造成的肺损伤可能更严重.

表1 DPPC/POPC混合磷脂胶束粒径及分散性指数(PDI)Table 1 Particle size and dispersion index(PDI) of DPPC /POPC mixed phospholipid micelles

图5 DPPC/POPC混合磷脂胶束粒径分布及TEM表征Fig.5 Particle size distribution and TEM characterization of mixed DPPC/POPC micelles

图6 DPPC/POPC混合磷脂胶束TEM表征Fig.6 TEM characterization of mixed DPPC/POPC micelles

3 结论

3.1 由 π−A等温线结果可知,苯并[a]蒽对 DPPC/POPC混合磷脂膜的相变影响显著,会引起磷脂膜压缩−扩张过程中的能量耗散增大,呼吸功增加;结合弹性模量 Cs-1值分析可得,苯并[a]蒽会明显削弱膜的抗形变能力,造成膜的有序度降低.苯并[a]蒽产生的不利影响随POPC含量的增加更加明显.

3.2 BAM及增溶实验结果表明苯并[a]蒽嵌入于磷脂分子之间,DPPC/POPC混合磷脂对苯并[a]蒽有增溶作用.混合磷脂中 POPC含量增加会使形成的磷脂胶束平均粒径减小、分散性更好,进一步促进苯并[a]蒽的溶出.

3.3 苯并[a]蒽与 DPPC/POPC混合磷脂的相互作用既抑制PS的生理功能,又会影响苯并[a]蒽的溶解迁移,进一步增加苯并[a]蒽的暴露风险.同时DPPC、POPC相对含量的变化会使苯并[a]蒽的作用行为具有差异性,可能导致苯并[a]蒽与肺功能损伤的剂量−效应关系改变.