毕 珏,张振宁,刘雨佳,杨丹蕾,郑钦象,崔道雷,向 萍* (1.西南林业大学湿地学院,国家高原湿地研究中心,云南 昆明 6504；.西南林业大学生态与环境学院,环境修复与健康研究院,云南 昆明 6504；.温州医科大学附属眼视光医院,浙江 温州 507)

灰尘作为一种复杂、多相的粒子混合物,异质性强[1],来源广泛(土壤、大气沉积颗粒物以及家居材料的磨损脱落等)[2-4],化学成分复杂[5].室内灰尘被认为是人体摄入和积累污染物的途径之一[6-8].据统计,人们有超过 85%的时间在室内度过[9],且由于室内环境的密闭性,室内灰尘中的污染物浓度是室外灰尘中污染物浓度的数十倍[10].作为室内灰尘中负载的有毒污染物,重金属因其浓度高、检出率高[11],以及暴露后可对人类造成严重危害而被广泛研究.

近年,国内外已开展室内灰尘中重金属的研究,结果显示室内灰尘中重金属含量、富集程度高于室外灰尘[12-13].不同国家地区、不同功能区室内环境之间的差异,导致灰尘中重金属含量差异较大,而污染来源和影响因素也各不相同[14-15].粒径作为影响灰尘中重金属含量分布的原因之一.国外学者研究发现室内灰尘中的As、Zn、Cu、Pb、Ni易富集在90～150μm粒径范围,而Cd和Mn易富集在45μm以下[16],但 Csavina等[17]认为重金属易分布在小粒径范围.此外,Rashed[18]进一步研究发现灰尘中可溶性金属易被植物和生物体获得,应引起人们的重视.目前,针对室内灰尘重金属的研究,主要集中在其含量、来源、人体健康风险、不同粒径和空间分布特征等方面[19-23],研究较为单一,而国内目前较少关注灰尘中可溶性重金属对人体健康暴露的影响.

目前,干眼、角膜炎的发病率逐年上升[24].有证据显示,环境污染与眼表疾病的产生有关[25].流行病学也发现,灰尘暴露可引起眼部疾病的发生[26].眼表作为人体持续暴露于外界环境的组织之一[27],极易受外界污染物暴露的影响.研究证实,当人眼长时间暴露在办公室灰尘内,会导致人泪液中炎症细胞显著降低,即使人眼暴露在正常灰尘浓度(<0.001～3.2mg/m3)下,也可能诱导人角膜上皮细胞损伤[28].但目前仍缺乏室内环境污染对眼表疾病的系统认识,而灰尘作为有毒重金属汇集及迁移的媒介[29-30],当前已有研究发现 Pb暴露能够导致白内障等蛋白质聚集性眼部疾病的发生[31],从而影响人眼健康.

目前室内重金属污染研究区域多集中在沿海或平原较发达地区,昆明市属于典型低纬度高海拔区域,年平均辐射量可达 260.75MJ/m2[32],高强度紫外辐射中,会使人群眼表功能更加敏感和脆弱.本文以高原城市昆明的室内灰尘为介质,考察不同功能区(办公室、家庭住宅、学生宿舍)重金属的含量水平,评估高原室内灰尘对人眼角膜上皮细胞损伤的健康风险,旨在为有效防控高原居民眼表健康风险提供参考.

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

仪器:等离子发射光谱仪(ICP-OES, Agilent 710,美国安捷伦科技公司);总有机碳分析仪(Vario,德国元素);台式恒温摇床(TS-211HSGZ,上海天星);干燥培养两用箱(GPX-9162,上海跃进);二氧化碳培养箱(371,赛默飞世尔);实时荧光定量 PCR仪(Roche LightCycler®480 Ⅱ,瑞士罗氏);梯度 PCR 仪(Mastercycler Nexus Gradient, Eppendorf公司);酶标仪(SpectraMax® Plus 384, Molecular Devices公司,美国);低温高速离心机(5804R, Eppendorf公司);Mastersizer 3000激光粒度分析仪(Malvern公司,英国);试剂: CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司;抗菌-抗真菌剂(Antibiotic-Antimycotic)、胎牛血清(FBS)购自美国 GIBCO 公司;0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液购自武汉普诺赛生命科技有限公司;表皮生长因子EGF购自美国Life Technologies公司; RNA逆转录试剂盒购自日本宝日医生物技术有限公司; PBS磷酸盐缓冲溶液购自北京索莱宝科技有限公司; SYBR green qPCR master mix、总 RNA快速提取试剂、牛血清蛋白(CAS:9048-46-8)、溶菌酶(CAS:12650-88-3)购于南京翼飞雪生物科技有限公司、无水氯化钙(CAS:10043-52-4)购于上海麦克林生化科技有限公司;定量 PCR所用引物序列信息来源于哈佛大学 Primer Bank(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/),由上海生工生物公司合成.

1.2 样品的采集与处理

利用ArcGIS 10.2进行采样点布设,按昆明不同功能区划,供试样品于2019年4～12月期间使用真空吸尘器(Panasonic, MC-WGE61)采集样品,一共 41个室内灰尘样品,其中办公区 6个,学生宿舍及家庭住宅分别为16和19个,不同功能区采样点样品均为多点采集并分别混合成 1个样品,样品总量不少于2～5g.样品带回实验室除去毛发、絮状物、烟头等杂物,冷冻干燥后分别过 325 目(45µm)、250 目(63µm)、200目(75µm)、150目(100µm)、10目(2000µm)尼龙筛,放置于清洁的铝箔纸中,装入玻璃小瓶于-20℃冰箱保存备用.

灰尘重金属含量测定:按照美国 EPA的 USEPA 3050B方法[33],每个样点设置3个平行,分别称取4个不同粒径及<100μm的200mg灰尘样品于消解管内,加入10mL 1:1硝酸浸泡24h,放入消解炉内105℃下回流加热蒸发至2mL,冷却后加入2mL 30%浓度的过氧化氢,再次在105℃下消解至近干, 0.1mol/L的硝酸定容至50mL,使用0.45μm滤头过滤至离心管中,最后利用ICP-OES测定灰尘中重金属Pb, Cu, Cd, Zn, Cr,Ni, Co, As, Mn的含量.为保证分析结果的准确性,玻璃器皿用25%硝酸溶液浸泡24h以上,自来水、去离子水各清洗 3遍以上; ICP-OES加标回收率为(93.5%～110.6%),测定结果均达到质量控制要求.分析测试过程中重金属标准品购于国家标准物质中心,所用水均为二次去离子水,试剂均为分析纯.

灰尘粒径测定:将收集的不同功能区灰尘分别通过2mm的尼龙筛,除去毛絮状和其他杂物,使用激光散射方法[34],通过Mastersizer 3000激光粒度分析仪分别测定3次,并计算平均直径.

灰尘中目标重金属生物可给性测定:考虑到粒径小于 100μm的灰尘更容易被人体吸附[35],各称取上述不同功能区<100μm 室内灰尘 0.70g,并设置 3个平行,将灰尘加入到装有 35mL模拟人工泪液(配方改自Weng等[36]磷酸缓冲盐溶液0.01mmol/L、氯化钙 0.01mmol/L、牛血清蛋白 0.1mg/mL、溶菌酶0.1mg/mL)的聚丙烯(polypropylene)离心管中,并同时加入抗菌-抗真菌溶液(终浓度 3%),涡旋振荡5min,混匀后,使用摇床分别振荡6h, 12h, 24h,振荡完成后将离心管放入超声波清洗机中,低温连续超声4次,15min/次,超声功率为90%,用0.22µm的一次性滤头过滤超声后的灰尘混合液,通过ICP-OES测定灰尘中可溶性目标重金属含量.灰尘中目标重金属生物可给性由下式计算[37]:

式中: BA为室内灰尘重金属在模拟人工泪液中的生物可给性, %; DS为室内灰尘重金属在模拟人工泪液中溶解态含量, mg/kg; TS为室内灰尘中重金属总含量, mg/kg.

1.3 灰尘暴露液配置

称取粒径<100μm 办公室灰尘 0.064g溶解于50mL人工泪液中,同时加入抗菌-抗真菌溶液(终浓度 3%),涡旋振荡 5min,使其充分混匀后放入摇床振荡 24h,之后将离心管放入超声波清洗机中,低温连续超声提取 4次, 15min/次,超声功率为 90%,用0.22µm 的无菌一次性滤头过滤超声后的灰尘母液(1280μg/mL),锡箔纸包裹于 4℃冰箱备用.据文献报道正常室内灰尘浓度在<0.001～3.2mg/m3范围内[28],相关室内灰尘对人眼角膜上皮细胞损伤研究中,灰尘暴露浓度在1～1000[38], 10～500[39], 50～3200[35]μg/mL不等,因此本文将灰尘暴露液浓度设置为20, 40,80, 160, 320, 640μg/mL.

1.4 人角膜上皮细胞培养、细胞形态和活力检测

在测定细胞活力之前,使用 DMEM 高糖培养基稀释灰尘母液.人角膜上皮细胞(HCECs)来自于浙江省温州大学附属眼视光医院.HCECs细胞生长于含有10%胎牛血清、1%抗菌-抗真菌剂和10ng/mL的表皮生长因子的高糖DMEM细胞培养基中, 37℃、5% CO2条件下培养,当细胞融合达到 80%以上进行传代,按照不同实验目的,分别接种到 96/6孔板中.细胞活力测定:以 1×104个 cells/100μL/孔的密度将HCECs细胞接种到 96孔板中.待细胞融合度达到70%～80%时,依次加入0(对照组, DMEM), 20, 40, 80,160, 320, 640μg/mL灰尘暴露液, 37 ℃ 5% CO2条件下暴露 24h后,倒置显微镜下观察细胞形貌,并拍照.随后吸出灰尘暴露液,加入 CCK-8细胞活力检测试剂,在二氧化碳培养箱中孵育 4h,完成后用酶标仪在450nm波长下测定OD值,计算细胞活力以及半数致死浓度值(LC50),实验时每种处理设置5个平行孔,并重复CCK-8细胞活力检测实验3次取平均值.

1.5 实时定量PCR技术分析炎症基因表达

待6孔板中细胞铺满约80%皿底面积时进行不同浓度20, 40, 80, 160, 320, 640μg/mL灰尘暴露液染毒,染毒24h后进行总RNA提取.待总RNA提取完成后,使用翼飞雪生物科技 cDNA第一链快速合成试剂盒(去基因组)进行 cDNA 的合成,步骤如下:取1000ng RNA,配制20μL反应体系.反应条件: 37℃15min, 85℃ 5秒(反转录酶的失活反应), 4℃下保温.待逆转录反应完成后,将cDNA稀释5倍后按照试剂盒说明配制 20μL的 PCR反应体系.检测目的基因IL-1β, TNF-α的表达水平,引物序列如表1所示,反应平台为Roche LightCycler®480 Ⅱ,平行孔设置同1.4.中CCK-8细胞活力检测相一致.

表1 促炎症基因qRT-PCR引物序列分析Table 1 qRT-PCR primer sequences for pro-inflammatory genes analysis

1.6 数据统计分析

实验数据通过(平均值±标准差)表示, GraphPad Prism 8软件进行统计学分析,灰尘中重金属总含量、不同粒径重金属含量以及目标重金属溶出率实验结果采用 Two-way ANOVA法, CCK-8细胞活力、细胞炎症因子 IL-1β和 TNF-α实验结果采用One-way ANOVA法比较有无显著性差异,以上实验结果若P<0.05,则认为差异有统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 昆明室内灰尘中重金属含量特征

如表2所示,分别对昆明地区居民住宅(简称 R)、办公室(简称O)及学生宿舍(简称D)<100μm 的混合灰尘中重金属总量分别进行测定,其中居民住宅灰尘中目标金属平均总含量为Cd (8.36mg/kg) < Co (13.6mg/kg)< As (15.7mg/kg) < Cr (47.5mg/kg) < Pb (114.5mg/kg)

表2 不同类型室内灰尘中重金属总量及可溶解率Table 2 Total concentration and solubility of heavy metals in three indoor dust samples

昆明室内灰尘中重金属Cd, Ni, Zn的平均总含量分别是云南省昆明市土壤背景值[40]的(R:52.3、O:39.3、D:28.8 倍); (R:4.5、O:9.5、D:5.9 倍); (R:10.7、O:12.3、D:11.2倍).经统计分析(Two-way ANOVA法),昆明市办公室灰尘中Ni, Mn, Zn显著高于居民住宅及学生宿舍(P<0.01),而其余金属元素在各类型室内灰尘间的含量无显著差异.此外,办公室灰尘中的Cr和Pb都高于家庭和宿舍.相比其他两个区域,办公室空间更为密闭,空气流动性差,同时该区域经常使用电脑和打印机[41],这些行为可能导致其灰尘中的重金属 Cr, Pb含量高于家庭和宿舍.本文还比较了国内外各城市地区不同类型室内灰尘重金属含量(表3),由于Co, As的相关研究较少,因此重点关注其余7种重金属.Cr, Cu, Pb, Mn和Zn含量水平高于中国河北[22]及兰州[42](除去Cr)、加拿大Toronto[43](除去Cu)等国内外城市.宿舍灰尘中Cr含量低于中国北京、兰州,马来西亚及印度等地[13,44-46].此外,本文区室内灰尘中Ni含量高于表3中所列国家和地区.有研究者认为不锈钢器皿的使用和驱蚊线圈的燃烧可能是室内Ni浓度升高的原因之一[47-48].同时,粒径也可能影响Ni在灰尘中的分布,例如Doyi等[16]发现Ni易富集在150μm粒径以下.此外,家庭灰尘中Pb和 Zn含量水平低于中国合肥[14]、澳大利亚Sydney[30]、埃及 Alexandria[49]和俄罗斯Chelyabinsk[50]等地.以上 4个城市人口密度均大于昆明,大量的人口以及繁忙的交通可能会导致重金属含量的增加.Alexandria是埃及最大的海港,该地区道路灰尘中 Pb的浓度达 260mg/kg.尽管埃及自2000年开始逐步淘汰含铅汽油,但土壤中沉积的铅可能会通过再悬浮进入该城市灰尘中.此外澳大利亚和埃及研究者[30,49]均认为房屋使用年限能够影响室内灰尘重金属含量分布.Sydney市中心房屋老旧,室内灰尘中 Pb浓度随房龄增加而增加(r=0.510,P<0.001),同样的Alexandria房屋居住年限在15～30a之间,旧房子内的油漆、地板及混凝土磨损风化可能导致重金属的释放.Praveena等[51]发现,墙壁油漆的颜色能够显著影响室内重金属的含量,例如黄色油漆可能会导致Cd、Cu、Pb和Zn的含量增加,而绿色涂料则导致 Zn含量升高.问卷和实地调查发现,本文进行灰尘采样房屋使用年限小于 5a,多为新建筑且墙体均为白色乳胶漆,因此昆明室内灰尘Zn含量低可能与此有关.

表3 昆明市室内灰尘中重金属含量与国内外其他城市对比(mg/kg)Table 3 Comparison of heavy metals in indoor dust of Kunming and other cities from the published data (mg/kg)

续表3

2.2 灰尘人工泪提取液中重金属溶出率

研究发现,被人体吸收的重金属能够造成细胞膜脂及蛋白质的氧化损伤,最终导致细胞死亡[52].前期研究发现,灰尘中并非所有的重金属均会被人体利用和吸收[25].泪液是覆盖于眼球前表面的一层液体,灰尘中的重金属污染物可能通过泪液这一介质最终接触到角膜上皮细胞,从而诱发潜在的毒性效应,然而尚未见灰尘中可溶出重金属对人眼表健康影响的报道,且大多数针对灰尘毒性的研究均以重金属总含量作为参考[53].为进一步了解金属元素在泪液中的溶出率,本文测定了灰尘中重金属在人工泪提取液中的可溶出浓度,结果如表2所示.3种不同类型灰尘中Cd、Cr、Cu、Mn、Ni在人工泪提取液中含量最高,且宿舍灰尘中的重金属在人工泪模拟液中的溶出率随着提取时间的增加而增加.通过分析每种目标金属的生物可给性发现,宿舍灰尘提取24h后目标重金属可溶解率由高到底依次为Mn(36.0%) > Cr (22.3%) > Cd (21.2%) > As (16.4%) >Zn (14.5%) > Cu (7.58%) > Ni (4.93%) > Co (3.42%)> Pb (2.54%).与宿舍不同,办公室灰尘中目标重金属的可溶解率分别为As (16.1%) > Cd (5.3%) > Co(3.99%) > Cr (3.92%) > Cu (3.88%) > Ni (2.71%) >Mn (1.86%) > Zn (0.02%) = Pb (0.02%).此外,灰尘提取24h后,居民住宅除As、Pb未溶出外,其余金属元素溶出率为Co (10.6%) > Cr (7.82%) > Cu (7.62%) >Ni (4.12%) > Mn (2.34%) > Cd (1.41%) > Zn (0.67%),其趋势与办公室相似.此外,与相似研究作对比发现,办公室和家庭灰尘人工泪提取液中 Ni、Cd、Cu、Zn等过渡金属溶出量低于灰尘Hank’s水提取液[54],可能是由于溶出介质差异导致.可见本文中灰尘重金属元素生物可给性均低于 36%,且可能以不同化学形态存在,如果以重金属总含量进行相关毒性或健康风险评价可能会高估其风险.

2.3 不同粒径室内灰尘中重金属含量分布规律

通过激光粒度仪对昆明室内灰尘粒径进行分析发现,办公室灰尘中<63μm 粒径占比为 61%,而500～150μm、150～63μm 各占 10%和 29%.居民住宅在 500～150μm、150～63μm 粒径范围占比相近(25.1%, 26.3%),<63μm 粒径占 48.6%.然而宿舍粒径分布与其他功能区有所区别,最大粒径占比在500～150μm 范围(39.3%),而 150～63μm 和 63μm 以下各占26.6%及34.1%.居民住宅、办公室及学生宿舍灰尘中值粒径分别为67.5, 53.6, 122µm.此外,据前人研究发现,室内灰尘的粒径范围从>2µm 到<63µm 不等,其中约三分之一的灰尘<500µm[41],本文结果与之相似.考虑到室内灰尘粒径在100µm以下易被人体吸附[35],并可能对人体健康产生危害.鉴于此,本文将粒径分为4个范围(F1:100～2000µm,F2:75～100µm, F3:63～ 75µm, F4:45～63µm),并探讨昆明市不同粒径范围室内灰尘中重金属含量分布规律.粒径作为表征灰尘理化性质的重要指标之一,粒径间的差异可能会影响灰尘中重金属含量的分布[58].通过 ICP-OES对不同粒径灰尘中重金属进行检测发现, 9种重金属在4个粒径中均有检出.由图 1可看出,重金属在各粒径之间的分布规律较为多变,这与其他研究相一致[59],同时部分重金属在不同粒径上的分布呈现不规则的波动.居民住宅灰尘中的 Zn、Mn、Ni、Pb、Cr、Cd、Cu 在不同粒径范围差异不显著.经分析可能由于本文中灰尘粒径范围之间相差较小,因此可能造成各重金属元素在不同粒径间含量差异不显著.宿舍和办公室灰尘中的Cr随灰尘粒径的减小而升高,这与曹治国等[44]对北京市海淀区室内灰尘中重金属的研究结果相一致.办公室及宿舍灰尘中Zn (857.7, 737.1mg/kg)、Mn(634.8, 367.6mg/kg)、Pb (163.51, 102.1mg/kg)、As(19.7, 18.5mg/kg) 4种元素易在 F2粒径(75～100µm)上富集.而宿舍灰尘中 Cu (209.8mg/kg)和Ni(402.0mg/kg)则在 63～75µm 粒径段达到峰值.本文结果还与McKenzie等[60]研究相一致,其认为地球化学组分中, 63μm 以下的灰尘易富集重金属,同时在该粒径范围内观察到Cr、Ni、Cu、Zn和Pb显著富集.此外,<100µm 的灰尘颗粒易再悬浮到空气中,由于人角膜上皮位置特殊,使得其长时间持续暴露在空气中,容易受环境污染物,如大气颗粒物、化学物质、病原微生物等因素影响,并引起一系列的并发症(角膜炎、红肿、角膜溃疡、异物感等),严重情况下能够导致失明[61].因此,选择粒径<100µm 室内灰尘进行角膜上皮细胞毒性效应研究.

图1 重金属在不同类型室内灰尘中的粒径分布特征Fig.1 Heavy metals concentrations across 4size fractions of three types of indoor dust samples

2.4 办公室灰尘人工泪提取液对角膜上皮细胞形态及活力影响

细胞形态改变是反映细胞生理功能紊乱和毒性的重要指标[62].本文发现, HCECs经办公室灰尘人工泪提取液暴露后,通过显微镜观察到随暴露液浓度的增大,细胞形态由多边形变为梭子形(图2(a)～(d),可能导致上皮间质转化的发生, HCECs转化为更具移动能力的间质细胞[63].同时由图 2(d)可看出细胞在 1280μg/mL浓度下,细胞缩小且部分细胞出现透明悬浮,提示细胞出现了死亡,有研究证明过度的炎症会导致程序性细胞死亡[64].鉴于此,本文借助CCK-8细胞活力试剂盒分析了HCECs经灰尘人工泪提取液暴露24h后对其活力的影响.结果如图2(e)所示,随暴露液浓度的增加细胞活力呈浓度依赖性.低浓度下(20μg/mL, P<0.05)灰尘人工泪提取液能够促进细胞增殖,可能原因是低浓度下能够引起细胞的应激反应,并激活了细胞增殖的相关分子通路[65-67].然而在40～320μg/mL浓度下,细胞活力未受到明显影响,可能原因是细胞受到刺激,激活了细胞的抵御机制,细胞通过自我调控来抵御外界不利刺激,处于动态平衡过程[25].而当暴露液浓度增加至1280μg/mL 时,细胞活力显著降低(86.2±7.3)%, P<0.01,这可能是因为外界灰尘浓度过大,产生的不利刺激远远超过了细胞的自身抵御能力,从而出现细胞活力降低[68].类似地, Huang等[52]比较了室内灰尘(250～2000μg/100μL)水提取液对肝癌细胞(HepG2)、人皮肤角质层细胞(KERTr)和肺上皮细胞(A549)毒性的影响,发现随着灰尘水提取物浓度的升高,细胞活力逐渐降低,并且对 KERTr细胞的抑制作用比HepG2和A549细胞更早出现.此外,有研究将PM2.5暴露于小鼠角膜上皮细胞,发现活细胞数呈浓度依赖性下降,当浓度为 25～200μg/mL 时,细胞存活率为80%～90%.即使在实验最高浓度为 1200μg/mL 时,仍有60%的细胞存活[69].本文将细胞存活率与灰尘浓度进行非线性拟合,其中半数致死浓度(LC50)为2410μg/mL见图2 (f).本文前期研究了南京室内灰尘水提取液对人角膜上皮细胞的毒性,其Hank’s灰尘水提取液暴露细胞24h后LC50为1278μg/mL[35],本文中LC50要大于其结果.灰尘中水溶性较好的重金属能够对细胞产生毒性作用[70],例如在细胞水平上,灰尘中包含Ni、Cd、Cu、Zn等过渡金属,可能通过诱导活性氧的产生,破坏膜脂、蛋白质和 DNA,从而导致细胞死亡.由于本文中模拟人工泪提取液所溶出的重金属低于Hank’s水提取液,因此诱导的毒性效应程度相对较低[35].也提示进行角膜毒性研究时,选择接近角膜组织的人工泪液较其他介质提取更为合理准确.

图2 办公室灰尘提取液对人角膜上皮细胞形貌和活力的影响Fig.2 Effects of office dust extract on morphology and viability of Human corneal epithelialcells

2.5 办公室灰尘人工泪提取液激活炎症基因 IL-1β和TNF-α的表达

空气污染物通过诱导炎症因子基因过表达,从而引起眼表炎症疾病,如角膜炎、结膜炎等[25-26].灰尘暴露细胞后也能够引起促炎症反应[71].然而人工泪液中生物可给态重金属是否会激活炎症基因表达仍然未知.本文将不同浓度 20,40,80,160,320,640,1280μg/mL办公室灰尘人工泪提取液暴露 HCECs,并利用实时定量 PCR技术检测分析典型眼表炎症因子白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因表达水平变化.如图3所示, IL-1β的mRNA相对表达量呈浓度依赖性,在40～640μg/ mL,分别增加3, 1.7和2.2倍.1280μg/mL浓度下其mRNA相对表达量显著上调并达到最大值(16.68),与对照相比增加了16倍.而TNF-α在> 40μg/mL时出现浓度依赖性降低,分别降低 0.75～0.82倍,在最高浓度(1280μg/mL)时显著增加至对照组的 2.4倍.本文中引起炎症因子 IL-1β和TNF-α基因上调,可能是生物有效态重金属诱发了细胞氧化应激反应,从而激活了下游的炎症相关信号通路[72].IL-1β作为先天免疫反应的最重要的促炎因子,在眼科疾病的发病机制中起着重要的作用,其能促进细胞炎症、细胞凋亡以及细胞外基质的积累[73].此外,灰尘中重金属诱导的氧化应激通常会激活NF-κB和AP-1等转录因子,诱导炎症因子(如 IL-1β)和趋化因子(如 TNF-α)的表达,从而引起炎症反应[74].本文结果和以往报道有所差异, Xiang等[35]发现,灰尘水提液暴露人角膜上皮细胞后,仅在50μg/mL浓度时TNF-α的mRNA显著升高,而 200,800,3200μg/mL 均下调.可能由于所用的提取液及灰尘样品的不同,造成所溶出的污染物浓度间有差异,最终导致细胞应对污染物刺激的分子机制也有所差别.

图3 办公室灰尘提取液暴露后诱导人角膜上皮细胞炎症相关基因表达Fig.3 Expression of inflammatory genes after office dust extracts exposure

3 结论

3.1 昆明市居民住宅、办公室及学生宿舍室内灰尘中重金属Zn(717.6, 825.5, 748.6mg/kg)平均含量最高, Cd平均含量最低(8.4, 6.3, 4.6mg/kg).办公室灰尘中 Ni, Mn, Zn显著高于居民住宅及学生宿舍(P<0.01),但其余6种金属元素含量无明显差异.此外,3种类型灰尘中Cd, Ni, Zn的含量均超过云南省昆明市土壤背景值.

3.2 室内灰尘中重金属在人工泪提取液中的溶出率低于36%,居民住宅中Co (10.6%)、办公室中As(16.1%)及学生宿舍中的Mn (36%)平均溶出率最高.宿舍灰尘中的重金属溶出率随提取时间的增加而增加,而居民住宅及办公室灰尘中Co, As, Cr, Pb的溶出率无明显的一致性规律.

3.3 Zn、Mn、Ni、Pb、Cr、Cd、Cu 在不同粒径范围(F1:100～2000µm, F2:75～100µm, F3:63～75µm,F4:45～63µm)差异不显著.办公室及宿舍灰尘中的Zn(857.7, 737.1mg/kg)、Mn(634.8, 367.6mg/kg)、Pb(163.51, 102.1mg/kg)、As(19.7, 18.5mg/kg)在75～100µm 粒径段达到最高值,宿舍灰尘中 Cu(209.8mg/kg)和Ni(402.0)在63～75µm达到最高值.

3.4 灰尘人工泪提取液暴露人角膜上皮细胞 24h后,能够引起HCECs细胞形貌由多边形变为梭子形,灰尘暴露液浓度为 1280μg/mL时,细胞活力显著降低(86.2±7.3)%,P<0.01,同时炎症因子IL-1β和TNF-α基因出现上调.