唐 圆，黄莉莉，谭周进，谢果珍

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

七味白术散为中国传统方剂，由炒白术、人参、木香、茯苓、藿香、葛根、甘草组成，有健脾益气、解肌止渴的功效，治疗脾虚泄泻效果甚佳[1]。中药成分复杂，具有多途径、多靶点治疗的优势[2]，七味白术散中有苷、多糖、挥发油、生物碱等成分[3]。苷类化合物是七味白术散中一类重要的药理活性成分，如人参皂苷，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡的作用，研究发现人参可以有效缓解与慢性肠道衰竭相关的胃肠道疾病，可减轻患者腹胀、腹泻等症状[4-6]，葛根素具有降脂、抗炎、胰岛素抵抗等活性，研究证明，葛根素具有止泻功能，能增加胃残留率，降低腹泻指数[7]，甘草素具有抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗癌以及增强记忆力等生物活性，是小儿泻宁糖浆中主要的活性成分，具有止泻作用[8-10]。因此，七味白术散中苷类成分可能是其治疗腹泻的主要成分。

苷类成分极性大，可溶于水，因此常用水提法，提取时间、提取次数、提取温度和料液比等均影响其得率[11]。Box-Behnken 响应面分析法表示不能用线性关系描述的函数，是一种经济有效的实验设计方法，广泛应用于生物工程、化学工业、分析化学、食品工艺等领域[12]。笔者将提取工艺与Box-Behnken 响应面分析法相结合，设计3 因素3 水平分析试验，旨在确立七味白术散总苷最佳的提取工艺，为七味白术散总苷的后续研究提供质量稳定的样品。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

UV1901PCS 紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）、KQ5200DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、循环水式真空泵（上海雅荣生化设备仪器有限公司）。

七味白术散处方药材购于湖南中医药大学第一附属医院，详细来源见表1。

表1 七味白术散处方药材来源

1.2 试验方法

1.2.1 七味白术散粗总苷的提取按比例称取七味白术散各味药粉碎后过60 目筛的粉末，置于烧杯中，加入14 倍体积的蒸馏水，煎煮2 次，53 min/次，合并水煎液浓缩至一定体积，加入无水乙醇，使乙醇终浓度为75%，搅拌均匀后4℃静置过夜。将乙醇提取液浓缩至20 mL，再依次用石油醚脱脂3 次（10、5 和5 mL），乙酸乙酯萃取3 次（15、10 和10 mL），合并乙酸乙酯层至蒸发皿中蒸干至恒重，水层继续用水饱和正丁醇萃取3 次（15、10 和10 mL）。合并正丁醇层至蒸发皿中蒸干至恒重，正丁醇部位和乙酸乙酯部位作为七味白术散总苷。

1.2.2 七味白术散粗总苷含量测定方法用课题组优化DNS 法测七味白术散总苷含量。

七味白术散总苷含量=水解后总糖含量-水解前总糖含量

七味白术散总苷提取率（%）=（水解后总糖含量-水解前总糖含量）×m2/M=[（ρ2-ρ1）×V1×V2×N/m1]×m2/M

式中：ρ1为七味白术散粗总苷中还原糖浓度（μg/mL），ρ2为七味白术散总苷水解后总糖浓度（μg/mL），V1为水解液定容后的体积（mL），V2为七味白术散总苷溶液体积（mL），N 为稀释倍数，m1为水解称量七味白术散总苷的质量（g），m2为提取七味白术散总苷的质量（g），M 为七味白术散粉末的质量（g）。

1.2.3 单因素试验设计对煎煮时间、料液比、提取次数逐一进行考察，每个因素5 个水平进行分析，得到最佳提取条件。煎煮时间的水平设定为15、30、45、60 和75 min；料液比的水平设定为1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12 和1 ∶14（g/mL）；提取次数的水平设定为1、2、3、4 和5 次。

1.2.4 响应面试验在单因素试验基础上用Design Expert 10 软件中的Box Behenken 设计原理，以七味白术散总苷的提取率为响应值，以煎煮时间（A）、提取次数（B）、料液比（C）为变量因素，设计3 因素3 水平的响应面分析试验（见表2），优化七味白术散总苷的提取工艺。

表2 提取工艺响应面设计因素水平

1.2.5 数据处理用GraphPad Prism 5 软件作图，用Design Expert 10 软件对单因素实验数据和响应面设计试验数据进行分析，绘制各单因素试验变化趋势图、建立线性回归方程、判断试验设计模型显著性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 煎煮时间对七味白术散总苷提取率的影响由图1 可知，煎煮时间对提取率影响较大，煎煮时间范围在15～60 min 提取率随着煎煮时间的延长而增加，当煎煮时间增加到60 min，提取率达到峰值后不再增加，反而呈现下降趋势。其原因可能是煎煮60 min 苷类成分充分溶出，而继续煎煮则部分苷类物质发生降解。苷类化合物的化学结构中有苷键，苷键容易发生断裂，如氧苷类化合物易降解形成半缩醛结构[13]，因此，选择最佳煎煮时间为60 min。

图1 煎煮时间对七味白术散总苷提取率的影响

2.1.2 提取次数对七味白术散总苷提取率的影响如图2 所示，提取2 次时七味白术散总苷提取率最高，超过2 次后提取率降低，其可能原因是提取次数越多，七味白术散中其他化合物如多糖、生物碱等溶出也越多，过滤后水提液的量越多，浓缩后其他物质可能会影响苷类物质的化学结构，从而影响对苷类化合物的检测。因此选择提取2 次为最佳提取次数。

图2 提取次数对七味白术散提取率的影响

2.1.3 料液比对七味白术散总苷提取率的影响如图3 所示，当料液比在1 ∶6 至1 ∶12（g/mL）范围内，七味白术散总苷提取率呈现上升趋势，当料液比调整至1 ∶12（g/mL）时，提取率增加到最大值，然后随着料液比的增加提取率下降。其原因可能是料液比在1 ∶12 时，苷类化合物的溶出基本完成，继续增加溶液，使七味白术散中其他物质的溶出增加，从而抑制了苷类化合物的溶出，因此选择最佳料液比为1 ∶12（g/mL）。

图3 料液比对七味白术散总苷提取率的影响

2.2 响应面试验

2.2.1 模型建立与显著性分析Box-Behnken 响应面分析法试验设计与结果见表3。

2.2.2 方差分析使用Design Expert 10 软件进行二次响应面回归分析，得到多元二次响应面回归方程为Y（%）=8.553+0.113A+1.242B+0.719C-3.469AB-2.893AC-0.014BC-5.948A2-0.194B2-0.020C2，方差分析见表3。

表3 Box-Behnken 响应面分析法试验设计与结果

由表4 可知，七味白术散总苷提取率的模型达到了极显著水平（P＜0.01），表明该模型对分析七味白术散总苷提取率具有合理性。相关系数R2= 0.934 8，该模型能解释93.48%响应值的变化，校正系数R2Adj=0.851 0 ＞0.8，变异系数c.v. %= 14.01，显示该模型的可信度较好，可以用来分析七味白术散提取率，根据表4 中F 值，推测影响七味白术散提取率的因素为提取次数（B）＞料液比（C）＞煎煮时间（A）。从表4中得知，二次项AC、C2对响应值具有显著影响（P＜0.05），A2、B2对响应值有极显著影响（P＜0.01）。

表4 试验结果的方差分析

2.2.3 响应面分析等高线形状反映各因素交互作用的强弱，椭圆形表示两因素之间的交互作用显著，椭圆的中心点即是响应面的最高点，也是模型得到的最佳条件[14]。由图4 可知，响应面的坡度顺着提取次数最大，结合方差分析结果，提取次数的交互作用对七味白术散总苷提取率的影响最显著，料液比次之，煎煮时间的影响不显著。

图4 各因素交互作用对七味白术散总苷提取率的影响

使用Design Expert 10 软件分析可知，七味白术散总苷最大提取率为0.67%，此时最佳提取条件是煎煮时间52.90 min、提取次数1.87 次，料液比1 ∶13.69（g/mL），考虑到实际操作的条件，将提取条件修改为煎煮时间53 min、提取次数2 次、料液比1 ∶13.7（g/mL）。

2.3 验证试验

根据Design Expert 10 软件优化的提取工艺，对优化工艺进行3 次验证，结果七味白术散总苷的提取率分别为0.71%、0.70%、0.72%，提取率的平均值为（0.71 ± 0.01）%，相对标准偏差RSD=1.02%，实际值与预测值接近，说明该提取工艺稳定。综上所述，该优化工艺方案具有可靠性，可用于实际应用。

3 结 论

通过响应面优化了七味白术散的总苷提取工艺，结果表明：七味白术散总苷的最佳提取工艺为煎煮时间53 min、提取次数2 次、料液比1 ∶13.7（g/mL），在此工艺下，七味白术散总苷的平均提取率提升至（0.71±0.01）%。