朱学栋，许 攀，张晓芳，朱菲菲，何晓蓉

（重庆市渝东南农业科学院，重庆 400800）

淫羊藿是我国传统大宗中药材，为小檗科淫羊藿属多年生常绿草本植物。地上干燥部分入药，其主要化学成分为多种黄酮类有机化合物、木脂素、生物碱、挥发油等。具有调节人体内激素分泌、增强人体自身细胞免疫能力等重要生理作用[1-2]，广泛用于补肾壮阳、强壮筋骨、祛寒散湿等方面，现代中医药研究表明，淫羊藿具有良好的保健、抗癌抗肿瘤效果[3]。全球淫羊藿属植物约56 种，我国约47 种[4]，占全世界淫羊藿属植物资源的83.93%，因此，我国是淫羊藿种质资源最丰富的国家，也是该属植物的现代地理分布中心。但《中国药典》规定药用淫羊藿品种仅为心叶淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、朝鲜淫羊藿和巫山淫羊藿的地上干燥部分[5]。其中，心叶淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、朝鲜淫羊藿植物总黄酮含量一般不低于5.0%，淫羊藿苷含量不得低于0.5%；巫山淫羊藿朝藿定C 成分含量一般不低于1.0%。我国淫羊藿产区现阶段还主要以野生资源为主，随着淫羊藿需求量大增，药民采用连根拔起的方式挖掘，导致野生资源锐减，质量参差不齐，在临床用药方面极不规范。

中药材指纹图谱能有效识别药材的真伪或产地，通过其主要特征峰的面积大小或比例限定，能有效控制药材质量。因此，笔者以重庆三峡库区的野生淫羊藿种质资源为研究对象，通过液相色谱峰的保留时间和峰面积构建当地野生淫羊藿种质资源的指纹图谱，为库区淫羊藿种质资源的开发利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试中药材供试中药材种类为淫羊藿，主要收集于重庆三峡库区，共20份淫羊藿野生种质资源（详见表1）。

1.1.2 试验仪器Agilent 1260 高效液相色谱仪 （包括：真空脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱、DAD 检测器，美国），KQ2200DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FA114 万分之一电子天平（上海豪晟科学仪器有限公司）。

1.1.3 试 剂淫羊藿苷对照品（批号：PCS-190218，购于北京世纪奥科生物技术有限公司，质量分数≥98%）；乙腈（色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司）；乙醇、甲醇（色谱纯，成都市科隆化学品有限公司）；流动相用水为实验室纯水机制取超纯水（赛默飞Direct-Qr3UV）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水（30 ∶70）为流动相，检测波长为270 nm，进样量10 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备取淫羊藿苷标准品适量，精确称量，加甲醇溶液制成0.1 mg/mL 的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备取供试品粉末（过50 目筛）0.2 g，精密称定，转移到带塞锥形瓶中，加入稀乙醇溶液20 mL，称定重量，超声处理1 h，再称定滤液重量，用稀乙醇补足缺失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

1.2.4 方法学考察（1）精密度试验：精密吸取同一供试样品，按照1.2.1 色谱条件进行方法精密度测定，连续进样5 次，考察保留时间和峰面积，计算RSD。（2）稳定性试验：精密吸取同一供试样品，按照1.2.1 色谱条件进行方法稳定性测试，样品分别放置1、2、4、8、24 h 后依次进样，分别考察保留时间和峰面积，计算得出RSD。（3）复性试验：按照1.2.3 制备5 份供试样品，再按照1.2.1的检测方法检测保留时间和峰面积，计算RSD。

1.2.5 主成分分析与聚类分析（1）主成分分析：以淫羊藿内含有机化合物的峰面积大小为主要变量，利用SPSS 统计分析软件对淫羊藿主成分进行分析。（2）聚类分析：通过SPSS 统计软件中Ward 联接聚类方法，利用 Euclidean 等距离测量分析技术，对20 份淫羊藿样品的液相色谱数据进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

精密度试验结果显示，RSD 为0.87%，小于3%，表明该方法精密度良好，符合指纹图谱构建的相关技术要求。稳定性试验结果显示，RSD为1.01%，小于3%，说明样品稳定性良好，符合指纹图谱构建的相关技术要求。重复性试验结果显示，RSD 小于3%，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱构建的相关技术要求。

2.2 指纹图谱构建

由表2 可知，峰面积RSD 差异较大，从1～11 号峰的RSD 分别为5.06%、249.2%、161.9%、80.1%、52.5%、57.7%、91.9%、138.1%、126.5%、62.8% 和117.1%，其中，2 号峰的RSD 最大，1 号峰RSD 最小。这表明不同品种不同地点收集的淫羊藿种质资源具有较大的差异性；其中1、4、5、6、8、9、10、11 号峰为20 份种质资源的共有峰。

表2 不同批次淫羊藿种质资源的峰面积

2.3 主成分分析与聚类分析

2.3.1 主成分分析如图1 所示，20 份淫羊藿种质资源中共检测出11 种成分，其中有4 个峰贡献率较大，特征值均超过1。

图1 20 份淫羊藿种质资源主成分分析结果

2.3.2 聚类分析聚类结果如图2 所示，20 份淫羊藿主要可分为3 大类，第一类为编号3、20、15、1、12、2、6 的样品，第2 类为编号8、14、7、4、5、9、10、11、13 的样品，第3 类为编号17、18、19、16 的样品。

图2 20 份淫羊藿种质资源聚类分析结果

3 结 论

通过收集重庆本地淫羊藿野生种质资源，以淫羊藿苷为标样，按照《中国药典》标准进行洗脱分离，该方法稳定，重现性好。构建得到重庆地区淫羊藿HPLC 指纹图谱。结果表明，不同收集地点，不同品种淫羊藿药材差异性较大，同一地点，同一品种之间相似性较高，且各品种之间有效药用成分含量差异大，同品种不同地点有效成分含量也有存在较大的差异性。因此，不同淫羊藿种质资源，通过更多优良的特异性状来区别对待[6]。通过指纹图谱建立，为更好地控制淫羊藿中药材内在质量提供科学依据，逐步规范淫羊藿用药，保护淫羊藿野生种质资源。