唐晓东，蒋春志，徐俊杰，张丽，樊翠芹，于翠红

（河北省农林科学院粮油作物研究所/河北省作物遗传育种实验室，河北 石家庄 050035）

植物激素是植物体内产生的一些微量但能调节自身生理过程的有机化合物，与植物生长发育密切相关，是研究植物代谢生理的重要内容[1～3]。准确测定植物激素种类和含量，对于植物的栽培生理、发育生理[4，5]以及抗性生理[6]研究具有重要作用。

虽然目前激素检测手段已经发展到质谱水平，但受限于仪器价格高昂，因此质谱技术在小麦激素检测方面的应用还很少[7～9]，液相色谱仍是植物激素检测的主要仪器。但是，已有的高效液相色谱检测植物激素方法一般只能检测2～4 种[10～16]，检测时间在25 min以上[11～13，17，18]，检测能力和效率还有很大的提升空间。基于对以上几方面的改进，采用高效液相色谱法对小麦激素测定进行优化，将植物激素检测种类提升至7 种，检测时间缩短到15 min，从而显著提高了液相色谱法在小麦植物激素的检测能力和检测效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试小麦品种为冀麦325。将Hoagland 营养液水培的小麦苗，取相同部位的叶片和根，3 次重复，称量后与钢珠一起置于2 mL 离心管中，于液氮中冷冻后在-80 ℃超低温冰箱保存，备用。

试验仪器有Agilent 1200 型高效液相色谱仪、ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱 （4.6 mm×150 mm）、eppendorf 5810R 型离心机、QIAGEN Tissue lyserⅡ组织破碎仪和减压蒸干装置（自研）。

试剂中，tZ（反式玉米素）、tZR（反式玉米素核苷）、α-萘乙酸（NAA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、赤霉素A3（GA3）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）和脱落酸（ABA）标准品均为索莱宝公司生产；甲醇（色谱纯）等色谱试剂为Fisher 公司生产；石油醚、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙酸乙酯、甲酸等提取试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦激素提取方法的改进 （1）取小麦根或叶片样品0.2 g 冷冻振荡破碎至粉状，加入事先已经预冷的含有30 μg/mL 二乙基二硫代氨基甲酸钠（DDTC）的80%甲醇1 mL，0～4 ℃避光浸提过夜。4 ℃下5 000 r/min离心10 min 后取上清液，残渣再用1 mL 上述提取液复悬，重复浸提2 h；相同条件离心后，合并上清液至10 mL 梨形瓶中，35 ℃减压蒸干。（2）依次用石油醚1 mL、磷酸缓冲液（pH 值8.0）1 mL 冲洗梨形瓶，重复1～2 次。（3）弃去醚层，保留水相，加入等体积的乙酸乙酯萃取2 次，并将乙酸乙酯转移至新的梨形瓶中。（4）用甲酸将剩余水相pH 值调至3.0，再次用等体积的乙酸乙酯萃取2 次，合并所有乙酸乙酯，然后35 ℃减压蒸干。 （5）用80%甲醇1 mL 溶解，过0.45 μm 有机滤膜后备用，待上机。上述步骤中，除减压蒸干外，其他步骤尽可能使用冰盒或冰袋，使样品转移过程一直处于低温状态。

1.2.2 激素检测色谱条件的优化

1.2.2.1 波长扫描与确定。将tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA 和NAA 标准品用80%甲醇溶解至适当浓度，在紫外可见分光光度计上进行全波长逐点扫描，记录各波长下的吸光度，汇总后确定检测波长。并在230～320 nm 波长范围内，每5 nm 进行1 次液相色谱验证。

1.2.2.2 初始色谱条件。ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱（4.6 mm×150 mm）；柱温45 ℃；流动相A 为甲醇，流动相B 为含有0.8%冰醋酸的水溶液：总流速0.8 mL/min；进样量20 μL；检测波长270 nm。进行梯度洗脱（表1）。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.2.3 柱温的优化。在初始色谱条件下，分别设定柱温为25、30、35、40 和45 ℃，其他条件不变，检验最佳的检测柱温。

1.2.2.4 流速的优化。在初始色谱条件下，分别设定流速为 0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 和 1.1 mL/min，其他条件不变，检验最佳的流速。

1.2.3 标准曲线的线性与范围 将tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA 和NAA 标准品用80%甲醇配制成不同浓度的标准溶液，采用1.2.2 中最终优化好的检测方法进行检测，采用浓度与峰面积拟合标准曲线。

1.2.4 样品检测与加标回收率

1.2.4.1 样品检测。采用1.2.1 中的提取方法提取小麦的根和叶片，并利用1.2.2 中最终优化好的检测方法进行检测，检验本方法的适用性。

1.2.4.2 加标回收率。将同一小麦叶片样品分成等量2 份，一份按1.2.4.1 的流程进行检测，另一份加入适量各激素标准品后再按照1.2.4.1 的流程进行检测，计算加标回收率。

2 结果与分析

2.1 提取方法的改进（不同pH 值条件下各类激素的提取效果）

用已知浓度的标品在不同pH 值条件下进行模拟提取，结果（图1，表2）显示，pH 值对不同激素的提取效果影响较大。在单一pH 值8.0 条件下，GA3几乎全部被提取出来，提取比例高达99.01%；其次是ABA 和NAA，提取比例分别为96.71%和93.50%；IAA的提取比例为74.30%，tZ 和tZR 的提取比例均约50%；而6-BA 几乎提取不到，提取比例仅3.77%。在单一pH 值3.0 条件下，各类激素的提取效果与单一pH 值8.0 条件下的提取效果相反：6-BA 的提取效果最佳，提取比例达到98.16%；其次是tZ 和tZR，提取比例分别为58.19%和50.84%；其他激素的提取比例均较低，提取效果较差。而在双pH 值条件下，可以避免单一pH 值条件下某些激素被破坏或难以提取的缺陷，互补效果显著，能最大程度地提高提取效果。

图1 不同pH 值对各类激素提取效果的影响Fig.1 Effects of different pH values on the extraction of various hormones

表2 不同pH 值条件下各类激素提取的峰面积Table 2 Peak area of hormone extracted under different pH values

2.2 检测方法的优化

2.2.1 吸收波长的选择 分光光度计波长扫描结果（图2）显示，在230～320 nm 波长范围内，除NAA 存在2 个吸收高峰外，其他激素均存在1 个吸收高峰；但各激素吸收高峰所处的波长位置不尽相同，其中，tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA、NAA 最大吸收峰的波长分别为 269、268、253、270、274、261 和 280 nm，NAA 次吸收峰的波长为271 nm。

图2 不同波长下各激素的吸光度Fig.2 Absorbance of hormones at different wavelengths

对液相色谱中各激素的单位浓度峰面积（峰面积与浓度的比值）变化情况（表3）进行综合考虑，本研究选用260 nm 作为最终检测波长。在该波长下可以兼顾本研究涉及到的7 种激素的峰面积响应，最大吸收峰距离260 nm 较远的GA3和NAA 均下降较少，单一地偏向一侧均会引起这二者中的一种吸光度急速下降，造成检测困难。

表3 不同波长下各激素单位浓度的峰面积变化Table 3 Change of peak area of unit concentration of each hormone at different wavelengths

2.2.2 流动相梯度 目前激素检测所需时间大多在30 min（含平衡时间）以上。本研究通过选择合适的色谱柱并配合优化后的流动相梯度，将检测时间缩短到 12 min 以内 （图 3），检测 1 个样品仅需 15 min（含平衡时间），检测速度提高1 倍以上，极大地提高了检测效率。

图3 标准样品色谱图Fig.3 Chromatogram of standard samples

2.2.3 柱温 柱温对激素的分离效果影响显著，特别是IAA 与ABA 之间的分离（图4）。随着温度的升高，IAA 与ABA 的分离度逐渐增大（表4）。其中，25 ℃下IAA 和ABA 的峰几乎为1 个，二者无法分离；30 ℃下二者分离度仅为1.10；35 ℃时分离度提升至1.68；40 ℃时二者基本分开，分离度达到2.24；45 ℃二者分离效果更佳，但有杂峰出现。因此，最终确定本研究的柱温为40 ℃。而且，较高的柱温还可在一定程度上提高检测速度。

表4 不同温度下IAA 与ABA 的分离度和末峰出峰时间Table 4 Separation of IAA and ABA and last peak time at different temperatures

图4 不同柱温条件下各种激素的分离效果Fig.4 Separation effect of various hormones under different column temperatures

2.2.4 流速 流速最主要的影响是出峰快慢，流速越高，出峰越早；同时还影响分离度（表5） 和峰型（图5）。各流速下IAA 与ABA 的分离度均＞2，其中0.6 mL/min 流速下分离度最大、效果最佳，0.8 mL/min流速下次之。流速除了影响出峰快慢和分离度以外，还对峰型有影响。流速越慢，峰宽越大，其中0.6 mL/min流速下各激素的峰宽均最大（表6），NAA 的峰型甚至变塌。综合考虑，最终确定流速为0.8 mL/min。

表6 不同流速条件下各种激素的峰宽Table 6 Peak width of various hormones at different flow rates

图5 不同流速条件下各种激素的保留时间Fig.5 Retention time of various hormones at different flow rates

表5 不同流速下IAA 与ABA 的分离度和末峰出峰时间Table 5 Separation of IAA and ABA and last peak time at different flow rates

2.3 标准曲线

7 种植物激素在各自的线性范围内，均与峰面积存在良好的线性关系，R2范围0.999 7～1.000 0（表7），激素浓度与峰面积之间呈显著正相关。

表7 各种激素的标准曲线Table 7 Standard curve of various hormones

2.4 样品检测与加标回收率

2.4.1 小麦样品的激素测定 采用1.2.1 方法分别对小麦根、叶中的激素进行提取并检测（图7），经计算，小麦根中的tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA、NAA 含 量 分 别 为 18.82、 17.78、 776.04、 12.92、20.24、7.59 和 16.17 μg/g；叶中的 tZ、tRZ、GA3、IAA、ABA、NAA 含量分别为 10.76、2.18、892.60、2.33、30.09、30.20 和 34.01 μg/g，6-BA 未检出。

图7 小麦样品色谱图Fig.7 Chromatogram of wheat samples

2.4.2 加标回收率试验 加标回收率试验结果显示，tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA、NAA 的回收率分别为91.45%±0.29%、97.96%±0.77%、96.65%±1.17%、93.40%±0.45%、104.21%±1.85%、92.61%±0.15%和96.65%±2.84%。该方法准确度高，能够满足小麦中7种植物激素定量分析的要求。

3 结论与讨论

本研究对高效液相色谱测定小麦激素的方法进行了优化，最终确定双pH 值条件（pH 值8.0 和3.0）对样品进行提取，使用甲醇与0.8%冰醋酸对样本进行梯度洗脱（时长15 min），柱温40 ℃，流速0.8 mL/min，检测器波长260 nm 的检测方法。该方法能同时测定7种激素 （tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA 和NAA），重复性好，回收率高，检测效率高于一般3～4 种激素检测的方法。同时本方法将检测时间缩短到15 min，单人24 h 内可完成近百份样品的提取与检测，远超每天二三十份样品的检测速度，极大地提高了高效液相色谱法在植物激素检测中的检测效率。而且该方法具有很好的拓展性，能较容易地应用到其他作物的激素检测研究中。

需要特殊说明的是，目前大多数植物激素检测选用 254 nm 作为检测波长[11～13，17，18]，本研究通过波长扫描发现，各类激素的吸收峰峰型以及最大吸收峰所处的波长各不相同，其中，GA3的最大吸收峰处在250 nm，NAA 的最大吸收峰处在280 nm，其他激素的最大吸收峰处在二者之间。所以检测波长太过偏于一测，会造成最大吸收峰在另一侧的激素的峰面积响应急速下降，从而降低该激素的检测效果。范光宇等[11]就曾经使用254 nm 波长检测NAA，发现其标品色谱峰中NAA 的峰面积明显小于其他激素的峰面积，怀疑是NAA 对该波长光吸收响应太低所致。因此，检测波长需要根据样品所含激素的种类与含量进行调整，必要时进行双边测试。

另外，由于植物激素具有含量低、易破坏的特点，因此想要获得理想的实验结果，提取细节尤为重要，如整个提取过程需尽量简化步骤、缩短流程且保持较低温度，以减少激素的损失。

最后实验样品的色谱图中除了待测峰以外，还存在一些杂峰且与待测物质相邻，尚未能鉴定，怀疑可能有其他激素或激素修饰物存在，因此该方法还有进一步优化的潜力。