于祎飞，武亚敬*，李迎超，郭恒，任俊杰，张薇

（1.河北省林业和草原科学研究院，河北 石家庄 050061；2.中国林业科学研究院林研所，北京 100091；3.河北子水农业科技有限公司，河北 邢台 054000；4.河北省红崖山国有林场，河北 易县 074200；5.邢台市林木种苗管理站，河北 邢台 054000）

我国是苹果生产和销售大国，2018 年我国苹果种植面积约为207.17 万hm2，产量达3 923.50 万t，均居世界首位（FAO 统计数据）。随着苹果产业的飞速发展，生产上对苗木品质的要求越来越高，繁育优质幼苗越来越多地受到人们的关注[1～7]。在果树生产中，苗木质量是果树健壮栽培的基础，直接影响着树体的生长发育以及果实产量和品质。现阶段我国苹果品种的苗木繁育以嫁接繁殖为主，育苗受季节限制，苗木繁育速度慢，容易感染病毒，而目前国内的苹果主栽品种及砧木普遍带有病毒，带毒率一般为60%～80%[3]。红国光苹果是河北省林业和草原科学研究院通过芽变选种由国光苹果选育出的红色芽变新品种，经苹果锈果病类病毒PCR 检测，发现其母本带毒率达17.5%[8]。

苹果组织培养是采用无菌培养技术，将来自优良植物的茎尖、腋芽、叶片、鳞片、块根和球茎等器官以及它们的组织切片进行离体培养，使之在短期内获得大量遗传性一致个体的方法。由于离体技术处理严格，所以很容易脱除一些细菌病原及病毒，是复壮品种的有效措施。容器育苗是当今世界林木育苗的一项先进技术，在生产上已得到广泛应用[9～14]，与普通裸根苗相比，具有节约种子、苗木出圃率高，易于搬运规格和质量易控制，造林成活率高等优点[15，16]。但是，目前我国果树育苗仍以嫁接、扦插、裸根生产方式为主，与世界先进水平相比存在较大差距。

苹果组织培养快繁的主要过程包括初代培养（芽诱导）、继代培养、生根培养、栽前炼苗和栽后管理等[17，18]。为提高红国光苹果的扩繁效率，实现良种壮苗，根据其组织培养的生长特性，分别在组培扩繁各个阶段设置添加不同特异性物质的培养基处理。通过对红国光苹果组织培养中营养物质和生长素等添加剂的筛选，以期形成一套完整、高效的苹果组培快繁生产技术，为组培快繁技术应用于苹果无病毒苗木繁育和商业化生产提供技术支持，促进苹果产业的健康、快速发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验苹果品种为红光1 号。

1.2 试验方法

2018 年果树萌芽前（3 月15 日），在张家口市怀来县红国光苹果种质资源圃选择生长健壮、无病虫害的红国光苹果树，采集1 a 生枝条（长度＞1 m）100根，装入冰盒冷藏，迅速带回试验室，进行水培培养、初代培养、继代培养、生根培养、栽前炼苗和栽后管理。为确定适宜红国光苹果组培快繁方法，针对每个环节进行了培养基配方的筛选研究。

1.2.1 水培培养时水培营养液种类的筛选 将枝条置于25 ℃温室内进行水培，试验营养液种类为富里酸原液（fulvic acid，FA）10 000 倍水溶液（P1处理），每5～7 d 换1 次；以清水处理为对照（CK）。调查枝条发芽所需时间和换水次数。

1.2.2 初代培养时初代培养基成分的筛选 当水培的枝条抽生出2～3 片叶时截取茎段，依次用纯净水冲洗5 遍、酒精擦拭3 遍、蒸馏水冲洗3 遍；取嫩芽接种到初代培养基中进行培养，试验初代培养基成分设MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L（P）1、WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L（P）2和White+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L（P）33 个处理，每瓶接3 个，每处理11 瓶，3 次重复；然后，在光照强度2 000～2 500 lx、光照时间14h（白天）/10 h（夜间）、温度（25±2）℃条件下进行培养。30 d 后，调查污染率、褐化率和成活率。

1.2.3 继代培养时继代培养基成分的筛选 将获得的无菌外植体接种到继代培养基中进行培养，试验继代培养基成分设MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L（P）1、 WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L （P）2、White+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L （P）3、MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.03 mg/L （P4） 和 MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.07 mg/L（P5） 5 个处理，每瓶接 3 个，每处理11瓶，3 次重复；然后，在光照强度2 200～2 600 lx、光照时间14 h（白天）/10 h（夜间）、温度（25±2）℃条件下进行培养。45d 后，调查扩繁株数，并计算扩繁系数。

1.2.4 生根培养时生根培养基成分的筛选 选择继代培养获得的生长健壮（颜色嫩绿、植株粗度达到0.2 cm）、高度＞2 cm 的植株，取生长时间为28～32 d的芽，接种于生根培养基中进行培养，试验生根培养基成分设1/2MS+IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂4.5 g/L（P1）、1/2MS+IAA 0.8 mg/L+IBA 0.4 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂4.5 g/L（P2）和1/2MS+IAA 1.2 mg/L+IBA 0.8 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂4.5 g/L（P3）3 个处理，每瓶接3 个，每处理33 瓶，3 次重复；然后，在光照强度2 300～2 700 lx、光照时间14 h（白天）/10 h（夜间）、温度（25±2）℃条件下进行培养。40 d 后，调查生根情况，并计算生根率。

1.2.5 栽前炼苗时浸泡药剂种类的筛选 当组培苗平均生根3 条以上、根长度达到2 cm 后，移到室外遮阳炼苗3 d；然后将组培瓶口打开，在自然光下开瓶炼苗3 d 后将生根苗从培养基中取出，分别采用海藻素2 000 倍液+多菌灵2 000 倍液（P1）、海藻素2 000倍液（P2）和多菌灵2 000 倍液（P3）浸泡 5 min，并将根部多余的培养基清洗干净，然后移栽到轻基质（泥炭、珍珠岩、蛭石按体积比4 ∶3 ∶3 混合而成，下同）网袋容器中。40 d 后，调查生根情况，并计算生根率和炼苗成活率。

1.2.6 移栽炼苗时喷灌药剂种类的筛选 将清洗后的植株移栽到轻基质网袋容器中，在遮阳网下进行管理：第1 周采用药剂溶液进行喷灌，试验药剂种类设多菌灵1 000 倍液+阿司匹林50 mg/L 溶液（P1）、多菌灵1 000 倍液 （P2）和阿司匹林 50 mg/L 溶液 （P3） 3个处理；第2 周每天用清水喷灌1 次，保持基质湿润透气。待生根苗抽生出新芽后移出遮阳网。炼苗期温度控制在20～25 ℃、湿度为75%～85%。移栽10 d 后，调查生根情况，并计算生根率和移栽成活率。

2 结果与分析

2.1 水培营养液种类的筛选

P1处理的枝条发芽所需时间为13～15 d，中间需换营养液2～3 次，较常规方法提早发芽3～5 d、减少换水6～8 次（表1）。表明用富里酸原液的10 000 倍水溶液进行水培效果优于清水培养，不仅可促进苹果枝条提早发芽，还可有效减少换水次数，降低工作量。

表1 不同营养液水培枝条发芽所需的时间和换水次数Table 1 The sprouting time and water changing times of hydroponics branches with different nutrient solution

2.2 初代培养基成分的筛选

试验处理的嫩芽污染率为5.01%～8.08%，指标值顺序为 P2＜P1＜P3，其中 P1与 P3处理差异不显著，但二者均与P2处理差异达到了显著水平；褐化率为8.08%～45.45%，指标值顺序为P1＜P2＜P3，不同处理间差异均达到了显著水平；幼苗成活率为46.47%～84.85%，指标值顺序为P1＞P2＞P3，不同处理间差异均达到了显著水平（表2）。综合分析污染率、褐化率和成活率3 项指标，认为P1处理效果最好，即红国光苹果组培苗初代培养的最佳培养基成分为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L。

表2 不同成分初代培养基的嫩芽成活情况Table 2 The survival of buds in primary culture medium with different components （%）

2.3 继代培养基成分的筛选

试验处理的外植体扩繁系数为3.33～4.67，其中P1处理的指标值最大、P5处理次之，二者差异不显著，但均显著＞其他3 个处理（表3）。表明P1处理效果最好，即红国光苹果组培苗继代培养的最佳培养基成分为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L。

表3 不同成分继代培养基的扩繁系数Table 3 The propagation coefficient of subculture medium with different components

2.4 生根培养基成分的筛选

试验处理的生根率为72.73～90.90%，指标值顺序为P1＞P2＞P3，不同处理间差异均达到了显著水平（表4）。表明P1处理效果最好，即红国光苹果组培苗生根培养的最佳培养基成分为1/2MS+IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L，在MS 培养基的基础上添加适量生长素类物质可明显促进红国光苹果组培苗生根。

表4 不同成分生根培养基的生根率Table 4 The rooting rate of rooting medium with different components （%）

2.5 栽前炼苗时浸泡药剂种类的筛选

试验处理的生根率为68.69%～90.90%，炼苗成活率为 72.74%～92.92%，指标值顺序均为 P1＞P2＞P3，不同处理间差异均达到了显著水平（表5）。表明P1处理效果最好，即栽前炼苗时增加用海藻素2 000倍液与多菌灵2 000 倍液混合液浸泡并将根部多余培养基清洗干净的环节，可明显促进组培苗生根，有效提高炼苗成活率。

表5 不同药剂处理后组培苗的生根率和炼苗成活率Table 5 The rooting and survival rate of tissue culture seedlings treated with different chemicals （%）

2.6 移栽后喷灌药剂种类的筛选

试验处理的生根率为75.86%～91.92%，炼苗成活率为 76.74%～93.94%，指标值顺序均为 P1＞P3＞P2，不同处理间差异均达到了显著水平；移栽成活率为75.86%～92.92%，指标值顺序均为 P1＞P2＞P3，不同处理间差异均达到了显著水平（表6）。表明P1处理效果最好，即组培苗移栽后1 周内用多菌灵1 000 倍液与阿司匹林50 mg/L 的混合液进行喷灌，可明显促进成活，有效提高移栽成活率。

表6 不同添加物对生根和炼苗成活影响Table 6 The effect of different additives on rooting and seedling survival （%）

3 结论与讨论

3.1 讨论

本研究中采用水培炼苗的方法，将组培苗闭瓶培养在富里酸原液的水培营养液，克服了常规炼苗过程中去封口膜后培养基干裂、霉菌过多繁殖的问题。

初代培养MS 培养基可以提供组织生长所需的矿质营养，在生长素类物质含量相同的条件下，该培养基较WPM 和White 培养基显著提高扩繁系数。继代培养过程中，在MS 培养基的基础上添加低浓度的生长调节剂有利于扩繁，但浓度过高或过低均不利于组培苗的培养。

不定根诱导是组培过程中关键的一步[19]，在碳源和矿质元素一定量的基础上添加生长素类物质有利于根系的形成。IAA 和IBA 不同添加量试验结果显示，添加IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L 时最有利于根系发育，浓度过高和过低都不利于发根。说明在碳源和矿质元素充足的条件下，适当添加生长素类物质有利于不定根的产生。

移栽苗基质的成分和粒径会影响到苗木的生长，不同基质含量影响基质的各项物理指标，进而影响到苗木的各项生理指标[20～24]，基质各项理化性状决定了苗木的品质。本研究条件下结果显示，选用泥炭、珍珠岩、蛭石按体积比4 ∶3 ∶3 混合而成的培养基，有利于组培苗的生根和成活。该配方基质能够在较短的时间内实现苹果新品种组培苗木的快速繁殖，保留了品种的优良特性，有利于该品种的保存。用多菌灵1 000 倍液与阿司匹林50 mg/L 溶液的混合液喷灌，可以起到很好的杀菌作用，既能防止植株感染，促进苗木快速生根，提高成活率，又能提高苗木的抗逆性。

3.2 结论

1 a 生苹果枝条进行水培时，营养液选用富里酸原液的10 000 倍水溶液效果较好。一方面，可高效提供营养成分，促进苹果枝条快速生长，较常规方法提早发芽3～5 d，节省组培时间；另一方面，可有效减少换水次数，降低工作量。

采用成分为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L 的培养基进行初代培养，成活率为84.85%，有利于红国光组培苗的建立。

采用成分为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L 的培养基进行继代培养后，扩繁系数达4.67。采用成分为 1/2MS+IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L+蔗糖 20 g/L+琼脂4.5 g/L 的培养基进行生根培养，生根率达90.90%。

栽前炼苗时采用海藻素2 000 倍液+多菌灵2 000倍液充分混合后浸泡5 min，并将根部多余的培养基清洗干净，不仅可以促进组培苗快速生根，还可以起到杀菌灭菌的作用，提高炼苗成活率。

移栽苗的管理方式为将生根苗在遮阳网下进行管理。第1 周采用多菌灵1 000 倍液+阿司匹林50 mg/L溶液混合后进行喷灌，可以起到很好的杀菌作用，促使苗木快速生根；第2 周每天用清水喷灌1 次，保持基质湿润透气。

本研究以红国光苹果的1 a 生枝条为试材，经过水培培养、初代培养、继代培养、生根培养、栽前炼苗、栽后管理，得到优质苗木，确定适合水培的添加物质，筛选出MS 培养基和适宜的的生长素类物质及含量，明确栽培基质的最佳含量比例以及栽前炼苗的海藻素和阿司匹林含量，形成了一套完整的组织培养技术，可为苹果无病毒苗木繁育和商业化生产提供技术支持。