孙宜琳，刘淑芹，蒋扬帆，曾玲玲，杨细凤，刘 杰

(湖北理工学院 肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435003)

0 引言

ATP6AP2基因(ATP酶辅助蛋白2)定位在 Xp11.4 染色体，编码一种与腺苷三磷酸酶(ATP酶)相关的I型跨膜蛋白，对许多细胞过程至关重要，如蛋白质运输、成熟、再循环或降解[1-2]。ATP6AP2蛋白与ATPases- V(液泡型蛋白质转位ATP酶)的跨膜区功能有关，又称为蛋白素受体(PRR)。作为V-ATPase辅助蛋白，参与了V-ATPase在内质网(ER)中的组装[3-4]。ATP6AP2最初被确定为肾素受体，在肾素-血管紧张素系统(RAS)中起到血压调节的作用[5]。此外，ATP6AP2在中枢神经系统中高度表达，其可能参与多种神经精神疾病的发生[6-7]。人类ATP6AP1和ATP6AP2的突变会导致多系统疾病，包括脂肪性肝炎、免疫缺陷和精神运动障碍[8-9]。我们的前期研究发现，ATP6AP2作为泛素化的底物之一参与了免疫调节类药物抗肿瘤作用。为了确认与ATP6AP2蛋白相结合的E3泛素连接酶，本文构建了ATP6AP2-GFP表达载体，旨在为ATP6AP2的生物学功能提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 cDNA 的合成

1 mL TRIZOL 试剂裂解1皿293T 细胞，加入200 μL氯仿，剧烈震荡，通过异丙醇沉淀法获得RNA。1%琼脂糖凝胶检测RNA的完整性，Agilent Technologies 2100检测RNA的质量。取总RNA 3 μg，依次加入 Oligo(dT)1 μL，10 × BUFFER 2 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTP mix 1 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，RNA酶抑制剂0.5 μL，加ddH2O至总体积达到30 μL,混匀 42 ℃温水浴 2 h,反转录合成cDNA，-80 ℃分装，保存。

1.2 PCR 扩增ATP6AP2基因的片段

人源的ATP6AP2 基因CDS序列(NM_005765.3)来源于NCBI 数据库( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。引物序列如下: ①上游引物 5'-CCGCTCGAGATGCAGTCTTTCCTGTCT-3'( 下划线部分为 XhoⅠ酶切位点) ; ②下游引物5'-GCACTGCAGATCCATTCGAATCTTCTGGGTC -3'(下划线部分为PST I酶切位点),扩增片段大小为1 053 bp。

以 293T 细胞 cDNA 为模板，PCR 扩增获得 ATP6AP2 基因的蛋白质编码区 DNA 序列。 PCR 扩增条件为: 94 ℃预变性 5 min ; 95 ℃变性 30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 个循环;72 ℃延伸 5 min;1% 琼脂糖凝胶电泳回收 DNA 产物。……