尹令虹 刘永军 刁青云

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093）

1 引言

蜜蜂作为一类重要的传粉昆虫，每年为全球农业生产做出巨大贡献[1]。但近年来世界多个地方均出现蜂群崩溃失调（CCD），造成这种现象的原因主要包括蜜蜂病虫害、真菌细菌感染、农用化学药品滥用以及多种因素的协同作用[2-4]，其中新烟碱类杀虫剂被认为是造成蜂群数量下降的重要因素[5]。新烟碱类杀虫剂具有神经毒性，在杀灭病害虫的同时，在水源、植物花蜜和花粉上也有残留，会对非靶向生物（比如蜜蜂）产生严重的影响[6]。新烟碱类杀虫剂主要作用于蜜蜂的中央神经系统[7]，阻断乙酰胆碱的正常传递，可诱导神经细胞凋亡[8]，蘑菇体失活[9]，从而因影响与采集行为相关的嗅觉、触觉感知以及学习记忆行为的编码[10,11]，导致蜜蜂辨别方向和飞行能力下降[12]，影响归巢能力[13,14]。

蜜蜂对于花朵气味和花蜜之间的联想学习记忆对于蜜蜂的采集行为起着重要的作用。蜜蜂学习记忆能力作为蜜蜂健康与否的外在表现，也是检测化学物质对蜜蜂是否安全的重要指标[15]。有研究表明野外蜜蜂在接触过新烟碱类杀虫剂后，记忆能力会下降，主要表现为工蜂的寻巢成功率下降[16]，归巢时间增加[17,18]。亚致死浓度的吡虫啉[19,20]或其主要的代谢产物[21]可以导致意大利蜜蜂短时程记忆和长时程嗅觉学习记忆受损[22,23]，Shi 等[24]的研究表明0.5、1、2μg 啶虫脒均会降低蜜蜂的学习记忆能力。

前人的研究大部分针对成年蜜蜂及蜂群开展研究，蜜蜂整个生命周期共经历卵、幼虫、蛹以及成虫4 个阶段，关于蜜蜂幼虫期暴露在新烟碱类农药环境中，出房后对蜜蜂影响的相关研究相对较少。Yang等[25]的研究表明幼虫阶段暴露0.04ng 吡虫啉，会影响成年蜜蜂的学习记忆。此外，目前已有的研究大多针对毒性较大的吡虫啉、噻虫嗪开展的，而对毒性较低的噻虫啉的研究相对较少。我们的研究旨在模拟野外蜜蜂实际生存情况，将意大利蜜蜂幼虫暴露于不同浓度的噻虫啉中，去探究亚致死浓度噻虫啉对意大利蜜蜂的发育以及嗅觉联想学习记忆能力在经过蛹阶段发育后是否仍然受到噻虫啉的影响，以期为噻虫啉的合理使用提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 供试蜜蜂

实验于2020年7月至2020年9月在中国农业科学院蜜蜂研究所进行，实验蜜蜂为西方蜜蜂（Apis mellifera），取自中国农业科学院蜜蜂研究所北京香山实验蜂场。

2.2 蜜蜂幼虫饲料制备

蜜蜂幼虫食物严格按照实验室饲养方法制备，按照培养天数的不同，饲料分为A、B、C 类（表1），分别由新鲜蜂王浆、酵母粉、果糖、葡萄糖和无菌水按不同比例配置而成[26]。根据蜜蜂幼虫发育时间分别提供不同种类的饲料，每只幼虫转移到实验室第1～2天提供饲料A 20μl，第3 天提供饲料B 20μl，第4 天提供饲料C 30μl，第5 天提供饲料C 40μl，第6 天提供饲料C 50μl。10mg 噻虫啉粉末溶解于1ml 二甲基亚砜（DMSO）溶液中，然后添加39ml 蒸馏水配备浓度为250mg/L 的噻虫啉初始溶液，将配备好的噻虫啉初始溶液分装成1ml 管后保存在-80℃冰箱。实验组幼虫食用经噻虫啉处理后的饲料制备，用配好的饲料稀释噻虫啉初始溶液分别得到浓度为0.5、1mg/L 的处理饲料，对照组幼虫提供未添加噻虫啉的正常饲料。

2.3 蜜蜂幼虫实验室饲养

取三张空白的蜂脾，将三只健康的蜂王分别关在不同的蜂脾上供其产卵，将蜂脾分别放入不同的蜂箱中。三日后将成功孵化出的蜜蜂幼虫小心转移到灭过菌的48 孔培养皿中，放到培养箱内饲养。培养箱温度为35℃，湿度为95%。每个浓度处理组在三个不同的蜂脾上各取48只蜜蜂幼虫组成三个生物学重复，即每个浓度组共取144 只幼虫。将蜜蜂幼虫转移到48孔培养板上的时间记录为第1 天（D1），整个饲养过程进行18 天（D1-D18）。D1-D6 为蜜蜂幼虫期，每天的饲料配方如表1所示。待饲养至第7 天将蜜蜂幼虫转移到24 孔培养板中继续饲养，此后蜜蜂幼虫进入蛹期，在蛹期培养箱温度保持35℃不变，湿度更改为75%，无需提供食物直至蜜蜂出房。在蜜蜂幼虫饲养整个过程中，每天统计幼虫存活数量，并且在第7天转换培养板时对每只幼虫进行体重测量。在幼虫饲养到第8 天，根据每只幼虫的发育情况，计算不同浓度组的化蛹率。在饲养的第19 天于早上8 时、下午3时分别统计不同处理组蜜蜂的羽化率。

表1 实验室幼虫饲养饲料配方

2.4 蜜蜂对蔗糖敏感性行为测试

在饲养的第19 天，从每个处理组随机选取40 只刚出房的蜜蜂进行伸喙反射（PER）的行为测试。将测试蜜蜂先饥饿处理2 小时后，将蜜蜂固定在空心塑料管中，保证其身体固定，头部露在管外并且可以自由活动，同时使用摄像头同步监测拍摄。首先进行蜜蜂对不同浓度蔗糖敏感性的测试：使用装有浓度为0.5%、1%、5%、10%、30%以及50%蔗糖溶液的注射器分别依次靠近蜜蜂触角3s，测试记录每只蜜蜂是否会主动发出伸喙反射，每个测试浓度间隔2 分钟，在测试过程中蜜蜂没有真正食用糖水。待测试完毕后，给予蜜蜂1μl 50%的糖水。

2.5 蜜蜂嗅觉学习、记忆行为测试

在蜜蜂对不同浓度蔗糖溶液敏感性行为测试之后，接下来对蜜蜂进行学习和记忆行为的检测，由于蜜蜂对蔗糖溶液具有正常敏感反应是测试学习记忆能力的基础，那些仅对50%蔗糖溶液敏感或者对任何浓度蔗糖溶液都没有伸喙反射行为的蜜蜂在学习记忆行为测试中被剔除了，每个处理组去除2 只蜜蜂。气味测试装置由只含有氧气的主气流（气流速度50ml/s）和含有己醛气味的刺激气流（5mg/L）混合组成。将浸润过10μl 己醛（Sigma-Aldrich，CAS# 66-25-1）溶液的试纸条置于刺激气流的气道中，使刺激气流含有己醛气味。将气味测试的管道口靠近蜜蜂触角，测试开始之前，只打开主气流30s，让蜜蜂适应一下气流，然后再进行学习和记忆行为测试。测试分为2 个阶段，（1）条件刺激阶段（CS）：保持主气流通道开放，同时打开刺激气流通道6s，同时在第3s 时给予蜜蜂蔗糖溶液作为奖励。（2）无条件刺激阶段（US）：保持主气流和气味刺激气流开放6s，无蔗糖溶液作为奖励，观察蜜蜂是否主动发生伸喙反射。

学习能力测试：蜜蜂每完成1 次条件刺激后进行无条件刺激测试，检验其是否主动发生伸喙反射，记录每只蜜蜂首次发生伸喙反射时使用条件刺激的次数；记忆能力测试：蜜蜂重复5 次学习能力测试后，以1 小时、3 小时和6 小时的间隔再次对蜜蜂进行无条件刺激测试，检验其是否主动发生伸喙反射并记录。每次记忆能力检测结束后将固定好的蜜蜂放回培养箱内，并且保持每1 小时喂食蜜蜂一小部分的蔗糖溶液以用来维持蜜蜂正常生理反应。

2.6 数据分析

采用SPSS Statistics 17 进行数据分析，使用GraphPad 进行作图。蜜蜂幼虫生存分析采用Log-rank检验；幼虫化蛹率、羽化率采用非参数检验；蜜蜂幼虫体重数据符合正态分布和方差齐性检验，采用单因素方差分析；蜜蜂蔗糖溶液敏感性以及学习记忆能力数据分析采用单因素方差分析检验。*P ＜0.05，**P＜0.01，***P ＜0.001。

3 结果与分析

3.1 亚致死浓度噻虫啉对蜜蜂幼虫存活率的影响

在蜜蜂幼虫转移到实验室的D1 到蜜蜂出房的D18 期间每天对蜜蜂存活情况进行统计，每个噻虫啉浓度处理组有3 个生物学重复。与对照组相比（图1），噻虫啉暴露降低了蜜蜂幼虫的存活率，高浓度1mg/L 组蜜蜂幼虫存活率与对照组相比显著降低，0.5mg/L 浓度组存活率与对照组相比虽然降低但是差异不显著。

图1 亚致死浓度噻虫啉对蜜蜂幼虫生存的影响

3.2 亚致死浓度噻虫啉对蜜蜂幼虫发育的影响

蜜蜂幼虫在发育期间，由于亚致死浓度噻虫啉的暴露导致幼虫发育迟缓。在整个饲养过程的第8 天蜜蜂幼虫进入蛹期，如图2-A 所示，1mg/L 浓度组（高浓度组）蜜蜂的化蛹率显著低于对照组；如图2-B 所示，在第19 天高浓度组蜜蜂的羽化率同样低于对照组蜜蜂的羽化率；在蜜蜂培养的第19 天的上午8 点和下午3 点分别两次对出房蜂进行收集，如图2-C 所示，对照组蜜蜂的出房时间主要集中在上午8 点，而实验组蜜蜂出房时间延后，特别是1mg/L 噻虫啉浓度处理组蜜蜂出房时间集中在下午3 时（图2-D）。

图2 亚致死浓度噻虫啉对蜜蜂幼虫发育的影响

3.3 亚致死浓度噻虫啉对蜜蜂幼虫体重的影响

蜜蜂幼虫在实验室内培养到第7 天时，转换培养板，同时进行体重测量，如图3所示，与对照组相比，0.5、1mg/l 浓度处理组蜜蜂幼虫体重与对照组相比，均无显著性变化，结果表明亚致死浓度噻虫啉暴露对于蜜蜂幼虫前6 天饲养阶段的体重无显著性影响。

图3 亚致死浓度噻虫啉对蜜蜂幼虫体重的影响

3.4 亚致死浓度噻虫啉对出房蜂蔗糖溶液敏感性的影响

如图4-A 所示，低浓度（0.5%、1%）和较低浓度（5%、10%）蔗糖溶液测试结果均显示噻虫啉处理组蜜蜂对糖产生喙伸反射的比率与对照组相比显著降低，高浓度（30%、50%）蔗糖测试结果显示实验组与对照组对蔗糖产生喙伸反射的比例均不再有统计学差异。结果说明在蜜蜂幼虫阶段接触亚致死浓度噻虫啉会降低出房蜜蜂对蔗糖溶液的敏感性，这种影响集中表现在低浓度（0.5%、1%）和较低浓度（5%、10%）蔗糖溶液中，随着蔗糖溶液浓度的增加，差异不再明显。图4-B 从噻虫啉对蜜蜂蔗糖溶液敏感性的剂量效应曲线可以看出，随着噻虫啉暴露浓度的增加，蜜蜂能够感受到的最低蔗糖溶液浓度不断上升。

图4 亚致死浓度噻虫啉对蜜蜂蔗糖敏感性的影响

3.5 亚致死浓度噻虫啉对出房蜂学习、记忆行为的影响

图5-A 为噻虫啉对第1 天出房的蜜蜂学习行为的影响曲线，结果显示在5 次嗅觉学习过程中，前2次学习测试结果均显示噻虫啉暴露会降低蜜蜂学习行为，之后3 次的学习测试结果虽然显示对照组蜜蜂产生条件喙伸反射的比例仍然高于实验处理组，但是已不再具有统计学差异。结果表明在幼虫期间进行亚致死浓度噻虫啉暴露可以降低出房后蜜蜂的学习能力，这种影响主要体现在前期的学习过程中，随着训练的次数增加，影响逐渐消失。图5-B 是噻虫啉对蜜蜂学习能力的剂量效应曲线，随着噻虫啉暴露浓度的增加，蜜蜂能够学会条件性伸喙反射所用的学习次数在不断上升。在学习训练后的1 小时、3 小时和6 小时的3次记忆测试过程中（图5-C），1 小时测试结果显示噻虫啉降低了实验处理组蜜蜂产生伸喙反射的记忆，而3 小时和6 小时的记忆测试结果，噻虫啉处理组和对照组就没有差异了。结果说明在幼虫期间进行噻虫啉暴露可以降低出房后蜜蜂的短期记忆能力，而对蜜蜂的长期记忆影响不显著。图5-D 噻虫啉对蜜蜂记忆能力的剂量效应曲线显示，随着噻虫啉暴露浓度的增加，蜜蜂保存气味联想记忆的时间越来越短。

图5 亚致死浓度噻虫啉对蜜蜂学习记忆的影响

4 讨论

蜜蜂外出采集花蜜花粉会不可避免地接触到新烟碱类杀虫剂，分析来自世界各地的198 份蜂蜜样品发现其中75%的样品至少含有对乙酰氨基吡啶、可比丁、吡虫啉、噻虫啉和噻虫嗪中的一种[27]，新烟碱类杀虫剂的系统特性，使得在植物花粉花蜜中都会有农药残留，此外在蜂箱以及蜂蜡等蜂类产品也检测到了新烟碱类农药的残留[28]。本研究模拟了野外蜂群受新烟碱类杀虫剂污染的一种途径，即外出工蜂采集受污染的花粉花蜜，通过分泌哺育幼虫的食物从而将新烟碱类杀虫剂传递给正在发育的幼虫。目前大多数研究大多针对新烟碱类杀虫剂对成年工蜂的影响作用，本实验评估了新烟碱类杀虫剂噻虫啉对蜜蜂幼虫发育以及出房后成年蜜蜂学习记忆行为的影响。

我们的研究结果显示1.0mg/L 的噻虫啉会显著降低蜜蜂幼虫的化蛹率、羽化率，延迟由幼虫到成虫的发育时间[29]；增大了蜜蜂幼虫的死亡率，从而影响了蜂群的数量。这可能是噻虫啉影响了蜜蜂幼虫一系列生理生化活动，比如降低幼虫免疫、排毒过程相关基因的表达[30]，进而影响幼虫的健康，导致死亡。但是相对较低浓度的噻虫啉对蜜蜂幼虫发育的影响不明显，前人已有的研究结果显示蜜蜂幼虫对新烟碱类杀虫剂的耐受性要比成年蜜蜂强，这可能是由于新烟碱类杀虫剂主要作用于蜜蜂大脑中乙酰胆碱受体，而该受体的表达在蜜蜂幼虫阶段相对较少，并且其主要的分布区域磨菇体（MBs）在幼虫阶段还没有发育完全[31]。

亚致死浓度的噻虫啉不仅影响蜜蜂幼虫的发育，同时降低了蜜蜂出房后成年蜜蜂的学习效率和短时程记忆。嗅叶是蜜蜂的嗅觉中枢，可以感受到蔗糖溶液的气味，进而将气味分子传递到用于感官整合的更高级中枢蘑菇体上[32]。新烟碱类杀虫剂在蜜蜂大脑中可以竞争性地与突触后膜上的乙酰胆碱受体结合，阻断神经信号的传导，由嗅叶接收到的蔗糖溶液的气味信息传送不到蘑菇体中，造成蜜蜂对蔗糖溶液敏感性下降[33]。蜜蜂学习记忆能力的形成主要与蘑菇体有关，当蘑菇体损伤后，蜜蜂自然有学习迟钝、记忆保存时间短等表现。Peng 等[34]发现亚致死剂量的吡虫啉使蜜蜂蘑菇体中的突触密度降低，Wu 等[8]发现亚致死剂量吡虫啉会增加蜜蜂大脑蘑菇体神经细胞的凋亡。

总之，我们的实验结果显示，虽然亚致死浓度的噻虫啉没有完全杀死蜜蜂幼虫，但出房后的蜜蜂学习和记忆能力都受到了不同程度的损伤，很可能影响成年蜜蜂的外出采集行为，比如采集花蜜花粉量减少，甚至无法正常回巢，从而影响整个蜂群。虽然噻虫啉相对低毒，但浓度较低的亚致死浓度就会对蜜蜂幼虫产生影响。我们的工作可以为安全使用噻虫啉提供一定的理论指导。