牛延菲 王鹏 张晓南 徐怡 曹红云 苏钛

摘要：目的 对雪上一枝蒿中多糖的含量测定方法进行研究，建立紫外分光光度法测定雪上一枝蒿多糖的含量测定方法，并考察不同产地、不同炮制方式对多糖含量的影响。方法 用80%乙醇回流去除还原性糖等杂质，后热水提取多糖，采用苯酚-硫酸比色法于488 nm波长处用紫外-分光光度法测得吸光度值，从而得出其多糖的含量。结果 雪上一枝蒿多糖以无水葡萄糖计，在0.003～0.015 mg/mL范围内呈良好的线性关系（R=0.9999），回收率为99.35%～99.85%（n=6），RSD值为0.18%。结论 本法准确、可靠，重现性好，适用于测定雪上一枝蒿中多糖含量;不同产地不同批次药材中的多糖含量存在一定差异;炮制方式对雪上一枝蒿多糖含量无显著影响。

关键词：雪上一枝蒿;多糖;紫外分光光度法;产地;炮制

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）05-0064-06

【Abstract】Objective： To observe the expression of HSP60 and Caspase-3 of acupuncture in rats with cerebral infarction and to preliminarily explore the protective mechanism of acupuncture on neuronal apoptosis in rats with ischemic stroke. Methods： The cerebral ischemia rats were induced by middle cerebral artery suture to make reperfusion injury models and randomly divided into sham operation group， model group， electroacupuncture point group， electroacupuncture non-meridian non-acupoint group and moxibustion acupoint group. After the intervention of electroacupuncture or moxibustion， the neurological deficit score and postural reflex score of the rats were evaluated at 0 and 12 hours after the operation. The expression levels of HSP60 and Caspase-3 mRNA were detected by fluorescence quantitative PCR. Results： The nerve function of the rats in the electro-acupuncture acupoint group and moxibustion acupoint group was better than that of the model group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Compared with that of the model group， the HSP60 mRNA of the electro-acupuncture acupoint group increased significantly， and the difference was significant（P<0.05） while the expression of Caspase-3 mRNA did not change significantly. Conclusion： Electroacupuncture can improve the neurological function of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. The mechanism may be related to the up-regulation of the expression of HSP60 in brain tissue and mediating anti-neuronal cell apoptosis.

【Key words】Ischemic Stroke; HSP60; Caspase-3; Nerve Cell Apoptosis

雪上一枝蒿為毛茛科植物短柄乌头Aconitum brachypodum Diels.的干燥块根[1]。其味苦、辛，性温，有大毒，主产于云南北部的东川、会泽等地，具有祛风镇痛的功效，用于治疗风湿疼痛、跌打损伤等症。雪上一枝蒿含有乌头碱、次乌头碱、雪上一枝蒿甲素等多种生物碱和β-谷甾醇、胡萝卜苷等非生物碱成分，其中生物碱主要是二萜生物碱，目前认为是其主要成分，雪上一枝蒿具有镇痛、局部麻醉、抗炎和抗肿瘤等药理作用[2]。以雪上一枝蒿为原料，开发了包括雪上一枝蒿注射剂、骨痛灵酊、云南白药气雾剂、云南白药膏、肿痛气雾剂等多种制剂，是云药产业发展中一个很具特色的品种。

多糖是一种广泛存在于生物体中含有很多生物活性的天然大分子物质，一些动物、植物及微生物都含有多糖，如肝素、铁皮石斛及真菌[3]，多数药用药材用中，菌类、藻类和根茎类中药材一般都含具有活性的多糖[4]，许多中药具有调节机体免疫系统、抗衰老、抗病毒、保护血管、抗炎、抗肿瘤等生物活性，这些生物活性都与多糖存在有关，多糖还具有毒副性小和无耐药性的特点，随着研究的发展，多糖也越来越被广泛应用于食品保健和医药等领域。

随着科学技术与知识的发展，国内外学者对雪上一枝蒿中的一些化学成分如一枝蒿甲素、乙素、乌头碱等生物碱类成分进行了系统的研究。其药用有效成分如一支蒿甲素[5]和二萜类生物碱类广泛被临床开发和应用。然而有关于其多糖的研究却很少，尚未发现有关于雪上一枝蒿多糖含量测定的报道，有文献显示，乌头属中植物多糖具有强化免疫功能、降血糖、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降胆固醇等生物活性[6]。因此拟参考《中国药典》[7]对铁皮石斛、玉竹、枸杞等一些药用植物多糖含量的测定方法以及文献报道的附子等乌头属植物中多糖的研究方法，对雪上一枝蒿中多糖的提取、显色及测定方法进行试验和研究，建立雪上一枝蒿多糖含量测定方法。由于雪上一枝蒿中多糖可能会受到地理因素和炮制方法的影响，因此利用建立的方法对不同产地和不同炮制方式的雪上一枝蒿多糖含量进行测定和分析，为雪上一枝蒿的进一步发展和在临床中的应用提供更加有利的依据和参考价值。

1 仪器与材料

数显恒温水浴锅（型号：HH-6，常州智博瑞仪器制造有限公司），电子天平（梅特勒-托利多，型号：AB204-N），电子天平（梅特勒-托利多，型号：AG285），低速离心机（上海卢湘仪，规格型号：TD4），紫外可见分光光度计（赛默飞世尔公司，规格型号：Evolution 300）。

苯酚（AR，批号F1601060，阿拉丁），硫酸（AR，批号20190701，重庆川东化工有限公司），蒽酮（AR，批号20130426，国药集团化学试剂有限公司），3，5-二硝基水杨酸（AR，批号20150921，国药集团化学试剂有限公司），酒石酸钾钠（AR，批号20140617，国药集团化学试剂有限公司），氢氧化钠（AR，批号20170412，国药集团化学试剂有限公司），亚硫酸氢钠（AR，批号120713，西陇化工股份有限公司），D-无水葡萄糖（含量以99.9%计，批号110833-201707，购自中国食品药品检定研究院）。

雪上一枝蒿药材采自云南东川、会泽、丽江，由云南省研究所正高级工程师高丽鉴定为毛茛科植物短柄乌头的干燥块根。研究用样品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 前处理方法选择

2.1.1 提取方式考察 《中国药典》2015年版一部，其中铁皮石斛、玉竹、灵芝多糖测定前处理采用热水提取后乙醇醇沉，黄精、枸杞多糖测定前处理采用80%乙醇回流去除杂质后再热水提取。参考药典及文献[8-16]，本文设计了以下两种前处理方法。

方法一：精密称取样品粉末（过4号筛）1 g，加水100 mL进行回流提取，取回流液10 mL于离心管中加无水乙醇40 mL，离心20 min（4000r·min-1），弃上层清液，将底部沉淀用热水转移并定容至25 mL容量瓶中，此为正提法，所得溶液即雪上一枝蒿多糖溶液。取1 mL多糖溶液加苯酚（5%）溶液1 mL，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，迅速摇匀，置水浴锅中沸水浴20 min，后冰水浴5 min，进行测定。

方法二：精密稱取雪上一枝蒿粉末（过4号筛）0.1 g，加乙醇50 mL，体积分数为80%，80℃水浴回流1.5h，趁热过滤，过滤后再用80%热乙醇10 mL进行清洗，洗3次，将滤纸和所得残渣继续加200 mL水，沸水浴回流2h。取出放冷后，移回流液10 mL于塑料离心管中离心20 min（4000r·min-1），所得的上层清液为雪上一枝蒿多糖溶液。精密移取所得的多糖溶液1 mL于10 mL的塑料离心管中。以下操作同方法一，根据标准曲线计算含量。

根据检测结果，方法一得到的多糖含量是方法二的2倍，采用碘化钾试液对其进行淀粉鉴别，提示方法一含有较多的淀粉，从而导致检测结果偏高，且平行样重复性较方法二差，因此选择先用80%乙醇回流去除还原性糖等杂质，后使用热水提取雪上一枝蒿多糖。

2.1.2 80%乙醇加入量考察结果 取本品粉末（过4号筛）约0.2 g，精密称定，共3份，分别加80%乙醇50、100、150 mL加热回流1.5 h，趁热滤过，以下操作同“2.1.1”第二法。根据检测结果，80%乙醇50、100、150 mL时，对多糖含量影响较小，50 mL已经可以去除杂质，因此选择80%乙醇用量为50 mL。

2.1.3 热水用量考察 取本品粉末（过4号筛）约0.2 g，精密称定，共3份，分别加80%乙醇50 mL加热回流1.5 h，趁热滤过，滤渣与滤器用热80%乙醇30 mL分次洗涤，滤渣连同滤纸置烧瓶中，加水100、200、300 mL，称定重量，加热回流2 h，以下操作同“2.1.1”第二法。根据检测结果，热水加入量为100、200、300 mL时，对多糖含量影响较小，加入量200 mL时，吸光度较合适（吸光度宜在0.3～0.7），因此选择热水加入量为200 mL。

2.2 显色方法选择 《中国药典》2015年版一部收载铁皮石斛、玉竹、灵芝、黄精、枸杞多糖的检测方法主要包括苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法。查阅相关文献，苯酚和蒽酮显色法实验操作简单，准确性与稳定性更好，在测定多糖的含量时使用率较高。为筛选准确的雪上一枝蒿多糖检测方法，本文对3种显色方法进行了对比研究。

2.2.1 苯酚-硫酸法 在浓硫酸的条件下，因加入苯酚使多糖水解产生糠醛衍生产物从而使溶液呈现出橙黄色，一般情况下所产生的颜色深则说明糖的浓度比较大，若颜色浅则说明所含的糖的浓度小。然后用紫外-分光光度计进行扫描，可得在488nm波长处多糖有最大吸收对应的吸光度值从而可以得知多糖含量，本文使用苯酚硫酸法显色雪上一枝蒿多糖，根据全波长扫描可知，该法在488nm处有最大吸收。

2.2.2 DNS法 利用二硝基水杨酸在一定条件下和还原糖发生氧化还原反应的方法称为DNS法，反应发生时在煮沸条件显棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸产物。本文使用DNS法显色雪上一枝蒿多糖，根据全波长扫描可知，该法无最大吸收，不适用于雪上一枝蒿多糖的检测。

2.2.3 蒽酮-硫酸法 在高温条件下时糖类被浓硫酸作用而脱水缩合生成呈蓝绿色的糠醛衍生物的方法为蒽酮-硫酸法，此法的最大吸收峰一般在620nm处出现。本文使用蒽酮硫酸法显色雪上一枝蒿多糖，该法在625nm处有最大吸收，但吸光度较低，灵敏度低。

2.2.4 结论 根据苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法3种显色方法的全波长扫描图可知，当采用苯酚-硫酸法进行测定时，无水葡萄糖对照品和雪上一枝蒿多糖在488nm处均最大吸收，峰型单一且吸光度合适，因此最终选则苯酚-硫酸法进行显色。

2.3 方法学考察

2.3.1 对照品溶液的制备 取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.3.2 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置20 mL具塞试管中，各加水补至1.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL（临用配置），摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在488nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0.2 g，精密称定，加80%乙醇50 mL，加热回流1.5 h，趁热滤过，滤渣与滤器用热80%乙醇30 mL分次洗涤，滤渣连同滤纸置烧瓶中，加水200 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，取10 mL，置10 mL离心管中，离心（转速为每分钟4000转）20 min，精密吸取供试品溶液0.5 mL，置具塞试管中，加水补至1.0 mL，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的重量（mg），计算，即得。

2.3.4 专属性与系统适用性 取本品粉末（过四号筛）约0.2 g，精密称定，按“2.3.3”供试品制备方法制备，对空白溶液、标曲中间浓度，依法进行全波长扫描，结果见图1。结果表明，488nm处空白溶液无明显吸收，对照品与供试品溶液均有最大吸收，表明本方法专属性良好。

2.3.5 线性关系考察 精密称取D-无水葡萄糖对照品10.21 mg，用水配制成0.102 mg/mL的对照品溶液。吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按“2.3.2”标准曲线制备方法制备，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表2。线性试验表明：无水葡萄糖在0.003～0.015 mg/mL范围内，线性关系良好，回归方程Y=74.913x-0.0085，R=0.999。

2.3.6 精密度试验 取0.6 mL对照品显色后的反应液，连续测定6次，重复性试验的RSD值≤2%，表明该方法仪器精密度良好。

2.3.7 重复性试验 精密称取雪上一枝蒿样品0.2 g，共6份，按“2.3.3”项下方法制备多糖溶液，上机进行重复性测定，RSD值≤2%，表明該方法重复性良好。

2.3.8 准确度试验 对照品溶液制备：精密称取无水葡萄糖30.00 mg加水定容到10 mL的容量瓶中，即得浓度为3 mg/mL的对照品溶液。

取已知含量（含量为6.145%）的本品粉末（过四号筛）约0.2 g，各6份，精密称定，分别加80%乙醇50 mL，加热回流1.5 h，趁热滤过，滤渣与滤器用热80%乙醇30 mL分次洗涤，滤渣连同滤纸置烧瓶中，加入上述对照品溶液2 mL，加水198 mL，其余按“2.3.3”项测定法，依法测定结果见表3。从结果可知，平均加样回收率为99.35%～99.85%，该方法准确度符合《中国药典》2015年版四部通则“9101药品质量标准分析方法验证指导原则”的规定（待测成分含量1%回收率限度为92%～105%）。

2.3.9 溶液稳定性 取本品粉末（过四号筛）约0.2 g，精密称定，按“2.3.3”制备供试品溶液，测定0、20、40、60、80、100、130 min的吸光度值，RSD值≤2%，表明供试品溶液在130 min内稳定。

2.4 样品测定

2.4.1 不同产地药材含量测定 取不同产地的15批药材，按“2.3.3”项测定，结果见表4。结果表明，云南东川、会泽、丽江产区的雪上一枝蒿多糖含量在1.2%～5.8%之间，不同产地不同批次药材多糖含量存在一定差异。

2.4.2 不同炮制方式含量测定 雪上一枝蒿为大毒药材，在使用时，本品须经过炮制方可入药。为考察炮制对多糖的含量影响，对民间习用炮制方法进行了调研，考察了蒸、煮、高压（121℃、15 min）炮制后不同温度（50、60、75、100、130、150℃）干燥的雪上一枝蒿饮片的多糖含量。结果见表5，根据检测结果，高压（121℃、15 min）炮制后的多糖含量出现升高，推测可能是由于高压条件下出现淀粉或其他物质的糊化引起的，有待于进一步研究，而蒸和煮炮制后多糖含量无明显变化。

3 讨论

多糖具有抗肿瘤、抗炎等多种药理作用、生物活性多样且毒性小。乌头属植物的临床应用和一些药理作用不能完全被二萜类生物碱成分解释，故有学者推测另一类生物活性成分多糖很可能也在乌头属植物的临床治疗及药物应用中发挥了重要作用。本论文首次建立紫外分光光度法测定雪上一枝蒿中多糖含量的检测方法，并按照《中国药典》2015版进行了方法学验证，验证结果表明该方法简便易行、准确度高。

为考察雪上一枝蒿多糖会受到地理因素和炮制方法的影响程度，利用建立的方法对不同产地和不同炮制方式的雪上一枝蒿多糖含量进行测定和分析。研究结果表明：不同产地不同批次药材多糖含量存在一定差异，云南东川、会泽、丽江3个产区的雪上一枝蒿多糖含量在1.2%～5.8%之间;蒸、煮透心后不同温度（50、60、75、100、130、150℃）干燥的雪上一枝蒿饮片的多糖含量无明显差异，高压（121℃、15 min）炮制后的多糖含量出现略微升高，推测可能是由于高压条件下出现淀粉或其他物质的糊化引起的，有待于进一步研究。

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