肖蕾 伍善东 刘东华

(湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009)

引言

植物内生菌是指能够定殖在植物组织内部，对宿主植物不造成任何感染或负面影响的一类微生物。实验室在对从油菜植株中分离得到的内生菌进行功能筛选时，发现1株具备多种生物功能的优秀内生菌株4-3。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

油菜内生菌：从健壮油菜根、茎的韧皮部分离得到；核盘菌ACCC37701(源自油菜)引自中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。

1.2 培养基

1.2.1 PDA加富培养基

20%土豆(煮汁)，2.0%葡萄糖，0.2%酵母膏，0.05%硫酸镁，0.1%磷酸二氢钾，1.8%琼脂，1.0mg V-B1，pH自然，27℃培养。

1.2.2 基本发酵培养基

1%玉米淀粉，2%葡萄糖，1%豆饼粉，0.1%硫酸镁，0.2%磷酸二氢钾，0.4%酵母膏，1.0mg V-B1，pH自然。装量100mL/500mL三角瓶。

1.2.3 PKO培养基

Ca3(PO4)25.0g，蔗糖10g，(NH4)SO40.5g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl 0.2g，酵母粉0.5g，1% MnSO43mL，1% FeSO4·7H2O 3mL，pH 7.0±0.2，蒸馏水1000mL。

1.2.4 蒙金娜有机磷培养基

葡萄糖10.0g，(NH4)SO40.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO40.03g，MnSO40.03g，Lecithin 0.3g，CaCO35.0g，酵母粉0.4g，pH 7.0±0.2，蒸馏水1000mL。

1.2.5 解钾培养基

蔗糖1.5g，MgSO4·7H2O 0.02g，CaSO4·7H2O 0.01g，NaCl 0.02g，钾长石粉0.5g，pH7.0～7.5，去离子水1000mL。

钾长石粉处理方法：将钾长石粉加入10%的HCl浸泡8～10h(期间每隔1～2h充分搅拌1次)，浸泡过夜。弃去上清液后用去离子水浸洗，充分搅拌，静止后弃上清液，再加入去离子水浸洗；如此重复多次，直至pH值检测无变化为止。将处理好的钾长石粉烘干后碾磨，过100目筛后装入瓶中备用。

1.3 油菜内生菌的分离方法

取油菜植株→冲洗→削取健壮白皙的根须及韧皮部→完全洗净后用滤纸吸干水分→75%乙醇浸泡12min→无菌水浸洗6次→0.2%HgCl2浸泡18min→无菌水浸洗9次(最后1次浸洗液留作对照)→将样品放入灭菌碾砵中→加无菌水4.5mL→碾磨成浆→去木质粗纤维→加无菌水4.5mL、继续碾磨成浆(20～30min)→吸取浆液0.5mL于装有4.5mL的无菌水试管中做系列稀释至5阶→倒序吸取0.5mL稀释液及对照浸洗液于倒好培养基的平皿中(平行3皿)→涂布均匀→于28℃恒温、正置培养(第2天倒置)3～5d→挑取不同形态的单个内生菌落。

挑取内生菌时应注意观察，选取不同菌落形态的菌株并根据对照平皿有无菌落生长决定是否挑取菌株。对照平皿一般无菌落生长，如有菌落出现则应视为污染菌或外生菌落，此时选取菌株应慎挑或不挑。

1.4 拮抗核盘病菌内生菌株的选择

1.4.1 对峙法初选拮抗菌株

将核盘菌ACCC37701斜面菌种用接种钩挑取少量菌丝点接种于倒好PDA加富琼脂培养基的直径为9cm的平皿中心。23℃恒温培养2d，待核盘菌丝萌发生长至直径为2cm大小菌落时；将所有第1批内生菌29株用接种环涂抹在周边的6个位点上，每个位点呈正六面体，间距为3cm，平行3皿。25℃恒温培养3d。挑选出7株内生菌对核盘菌ACCC37701具明显拮抗作用。

1.4.2 牛津杯法复筛拮抗菌株

挑取核盘菌丝ACCC37701斜面(带琼脂块)于倒好PDA加富琼脂培养基的直径为12cm的生化平皿中心。23℃恒温培养3d，待核盘菌丝萌发生长至直径为2～3cm(约铜钱大小)菌落时；将牛津杯3枚呈品字型放在核盘菌丝生长圈外(牛津杯外径5.0mm)。将在28℃、180r·min-1恒温培养了5d的初筛菌株菌液加注到牛津杯中，置无鼓风水隔式恒温箱中23℃恒温培养3d。观察到抑菌透明圈,并用游标卡尺测量记录抑菌透明圈直径。

1.5 内生菌株降解不溶性磷的生物功能选择、鉴定

1.5.1 降解无机磷内生菌株的选择

1.5.1.1 划线法

将所有分离的内生菌株用接种环在倒好PKO培养基的琼脂平板上划线，平行2皿。置无鼓风水隔式恒温箱中26℃恒温培养。培养6d后检查并记录结果。

1.5.1.2 点种法

初筛：将在划线培养中生长良好的34个菌株(呈等边三角形品字分布)点种在倒好PKO培养基的琼脂平板上，平皿直径为9cm，平行3皿。置无鼓风水隔式恒温箱中26℃恒温培养。5d后每天检查记录结果直至第8天。

复筛：将筛选出的7个菌株(呈等边三角形品字分布)点种在倒好PKO琼脂培养基的直径为12cm生化实验平皿上，平行3皿。置无鼓风水隔式恒温箱中26℃恒温培养。培养8d后，用游标卡尺测量并记录溶磷透明圈以及菌圈的大小，计算D/d比值。

1.5.2 降解有机磷内生菌株的选择

1.5.2.1 点种法初筛

将所有分离的内生菌株用接种环在倒好蒙金娜有机磷培养基的琼脂平板上点种，平皿直径为9cm，平行3皿。置无鼓风水隔式恒温箱中26℃恒温、倒置培养。培养5d后，每天检查结果并记录直至第8天。

1.5.2.2 点种法复筛

将筛选出的6个菌株(呈等边三角形品字分布)点种在倒好蒙金娜有机磷琼脂培养基的直径为12cm生化实验平皿上，平行3皿。置无鼓风水隔式恒温箱中26℃恒温培养。培养9d后，用游标卡尺测量并记录溶磷透明圈以及菌圈的大小，计算D/d比值。

1.6 降解不溶性钾内生菌株的选择

1.6.1 点种法初筛

用接种环将所有分离的内生菌株点种在倒好解钾培养基的琼脂平板上，呈等边三角形分布，平皿直径为9cm，平行3皿。置无鼓风水隔式恒温箱中28℃恒温、倒置培养。培养5d后，每天检查并记录结果直至第8天。

1.6.2 有效钾的检测

将筛选出的16株解钾菌株接种于液体解钾培养基中，以在液体培养基中不接入菌种的作为对照。500mL三角瓶装量80mL，28℃，180r·min-1培养15d。将培养液经过4000rpm离心处理15min取其上清液送至湖南省农业科学院农化检测中心采用火焰分光光度计检测发酵上清液中速效钾的含量，根据速效钾的测定值≥4.0ug·mL-1，筛选出9株优良的解钾菌株按相同的培养条件和方法进行复筛。

1.6.3 菌肥的小面积施用试验

1.6.3.1 播种

于2013年10月21日准备好1m2土壤3块，平整后，2块地分别均匀铺撒1#、2#菌肥2.5kg；对照地不施肥。撒播油菜籽“沣油958”；用耙齿稍稍耙动，用喷壶洒水使土壤湿润。

1#菌肥为4-3；2#菌肥为4-3、18-2；配比为1∶1。

1.6.3.2 移栽

于2013年11月19日将3块地上生长的种苗分别带土移栽到挖整好的试验地，尽量选取健壮、生长一致的菜苗，浇定根水后任其生长。3块试验地面积均等，1#地9行67畦135单株；2#地9行65畦132单株；CK地9行70畦136单株。

1.6.3.3 中途施肥

分别于2013年12月24日和2014年1月23日普遍施肥。方法及用量：50g脲加5g硼酸以水完全溶解后加30L水用喷壶普遍均衡喷洒。

1.6.3.4 收割、纯净、烘干、称重

于2014年5月19日将3组试验地油菜分别收割，先在3组地中分别随机抽取10个单株样本(测量株高、数分支、测单株产量)经晒干，脱粒，纯净、烘干后称重。

2 结果与分析

2.1 拮抗内生菌对核盘菌的抑菌效果

2.1.1 对峙法初选拮抗菌株的结果

挑选出7株内生菌对核盘菌ACCC37701具有明显拮抗作用。

2.1.2 牛津杯法复筛拮抗菌株的结果

实验结果表明，4-3菌号对核盘菌的抑菌能力最强，抑菌圈直径达19.3mm。抑菌圈直径大小依序为4-3>1-9>4-2>1-4>7-2>4-4>1-3；除1-3和4-4(放线菌)抑菌圈很小外，其余5株拮抗菌抑菌圈都很大，很明显。经穿刺法感染核盘菌试验证实，油菜定植拮抗菌后获得对核盘菌的综合抗感染率为98.5%，综合抗致病率为100%，见表1。

表1 拮抗内生菌对核盘菌的抑菌圈

2.2 降解无机磷内生菌株复筛的结果

2.2.1 划线法初筛降解无机磷内生菌株结果

有34个菌株生长良好，10个菌株不生长，5个菌株生长不好。

2.2.2 点种法初筛降解无机磷内生菌株结果

挑选出具有明显解磷透明圈，且透明圈带宽在2mm以上的优良菌株7株进行复筛。

2.2.3 点种法复筛降解无机磷内生菌株结果

按溶磷透明圈直径与菌圈直径大小的比值(D/d)排列顺序为18-2>11-1>4-3>8-2>1-3>6-1>1-9，实测数据具体见表2。

表2 降解无机磷内生菌株复筛结果

2.3 降解有机磷内生菌株复筛的结果

2.3.1 点种法初筛降解有机磷内生菌株结果

培养8d后，检查到生长良好且在菌苔周边有明显降解有机磷透明圈的菌株有9株。从中挑选解磷透明圈带宽在2mm以上的菌株6株进入复筛。

2.3.2 降解有机磷内生菌株复筛结果

按溶磷透明圈直径与菌圈直径大小的比值(D/d)排列顺序为10-1>18-2>7-1>18-1>4-3>13-1，具体见表3。

表3 降解有机磷内生菌株复筛结果

2.4 降解不溶性钾内生菌株的结果

2.4.1 点种法初筛降解不溶性钾内生菌株结果

菌落长势良好的菌株30株；菌落长势不是很好的菌株9株；10株菌落不能生长。从30株在解钾培养基上生长良好的菌株中选择具油滴状、菌苔凸起、有粘状膜、表面具光泽、菌体柔软、长势强盛的解钾菌株16株。按其菌落长势大小顺序排列为3-1>17-1>16-2>19-4>1-3>12-2>19-6>15-3>4-2>1-4>4-3>7-2>1-9>2-2>7-1>13-1。

2.4.2 复筛检测降解不溶性钾内生菌株有效钾结果

以2次测定值平均值的大小顺序排列为4-3>19-4>4-2>1-3>16-2>3-1>17-1>19-6>1-4，具体结果见表4。

表4 发酵上清液中有效钾含量

2.5 菌肥的小面积施用试验结果

2.5.1 抽样结果

从抽取的10个样品结果可以看出，1#菌肥的单株平均产量比对照高13.9%；2#菌肥的单株平均产量比对照高21.5%，具体见表5。

表5 各处理平均分枝数、平均株高、平均单株产量结果

2.5.2 完整试验结果

表6 各处理总产量

小面积试验结果表明，1#菌肥和2#菌肥均比对照增产明显。4-3单独使用的效果不如与18-2合用的效果好。

3 讨论

从上述4项功能菌的排序中能够看出，某些菌株号重复出现在序列中。在2项序列出现的菌株有1-9，拮抗核盘菌和降解无机磷；4-2，拮抗和解钾；1-4，拮抗和解钾；18-2，降解无机磷和降解有机磷。在3项序列出现的菌株有1株，为1-3，具拮抗、降解无机磷和解钾，其在序列排序中比较靠后。只有4-3菌株在这4项功能菌的排序中均有出现，且3项靠前；拮抗和解钾居首、解无机磷排第3，解有机磷排序稍靠后。4-3作为1株野生型的油菜内生菌具备优良的解磷、解钾和拮抗核盘病菌的多项生物功能，无疑是很优秀的菌株。