叶晓梦，曾 帅，石绪根，崔汝强

江西省莲花县百合病毒病分子鉴定

叶晓梦，曾 帅，石绪根，崔汝强*

（江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045）

【目的】为了检测和鉴定采自江西省莲花县百合样品。【方法】利用已报道侵染百合的3种主要病毒黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、百合斑驳病毒（lily mottle virus，LMoV）、百合无症病毒（lily syptomless virus，LSV）的特异性引物对样品进行RT-PCR分子检测与鉴定。【结果】扩增得到657 bp和428 bp 2条片段与CMV和LMoV预期片段大小一致，未检测到LSV。测序结果表明，扩增序列片段与GenBank的CMV、LMoV同源性分别为99.08%和98.56%。【结论】该地百合受黄瓜花叶病毒及百合斑驳病毒复合侵染。

百合；百合病毒病；多重RT-PCR

【研究意义】百合（var.）是百合科（Liliaceae）百合属（）多年生草本植物，喜凉耐寒。百合原产于中国，现主要分布在欧、亚和北美洲等北半球温带地区。百合具有重要的药用、食用和观赏价值，现已成为我国一种重要的经济作物。由于鳞片扦插是目前百合无性繁殖的主要技术，也导致了百合病毒的传播与扩散，严重降低了百合的观赏和经济价值[1-2]。【前人研究进展】我国栽培百合普遍受病毒侵染，病原和田间症状较为复杂。目前为害严重的病毒主要有3种，黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、百合无症病毒（lily symptomless virus，LSV）和百合斑驳病毒（lily mottle virus，LMoV），其它病毒为局部地区发生，为害较轻[3]。黄瓜花叶病毒百合株系（cucumber mosaic virus Lily strain）主要为害百合，可引起百合花叶病[4-5]，多为局部侵染。侵染百合后症状表现为轻型花叶、斑驳和扭曲，病叶最后脱水变褐；花畸形，花瓣开裂呈现长条纹状。重病株矮化，鳞片短不开花。百合斑驳病毒为马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，侵染百合后一般无症状表现或产生褪绿斑，与黄瓜花叶病毒复合侵染时产生花叶和坏死斑[5-8]。百合无症病毒单独侵染百合时一般无明显症状出现，但在一定温度下，某些品种会出现特异症状。如在15 ℃下侵染麝香百合幼苗一定时间，幼苗出现卷曲条纹（白色斑纹和叶片扭曲状）[8]。在自然侵染状态下，百合无症病毒和黄瓜花叶病毒复合侵染引起百合坏死斑病[4]。【拟解决的关键问题】本研究对江西省莲花县坊楼镇东边村百合谷的疑似病毒病花叶、卷曲等症状的百合病株，进行室内分子检测鉴定，采用多重RT-PCR技术实现了百合病毒病毒源检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百合病株于2019年采自江西省莲花县坊楼镇东边村百合谷。大肠杆菌DH5α为江西农业大学植物病理实验室保存。

克隆载体pMD18-T购自大连TaKaRa公司，RNA提取试剂Trizol、RNA反转录试剂、DNA聚合酶购自美国Invitrogen公司，2×RapidMaster Mix试剂盒、Clone Express® II One step cloning Kit购于南京诺维赞公司，DNA凝胶回收试剂盒购于美国Axygen公司，参照王冲[9]和徐榕雪[10]合成3对特异性引物，引物合成及克隆测序由北京新业擎科公司完成，引物序列见表1[9-10]。

表1 PCR扩增引物

1.2 总RNA的提取

使用Trizol法提取健康百合叶片以及感染病毒百合叶片总RNA。取0.1 g百合叶片于预冷的研钵中，加液氮充分研磨，将样品粉末转入2 mL预冷离心管；向样品离心管加入1 mL Trizol试剂，充分混匀后于室温放置5 min；加入200 μL氯仿，充分混匀后于室温放置2～3 min，4 ℃，12 000 r/min离心15 min；吸取上清置于新的预冷处理的1.5 mL离心管，加入500 μL预冷的异丙醇，轻轻混匀，室温放置10 min后低温高速离心10 min；弃上清，加入1 mL 体积分数为75%预冷的乙醇洗涤RNA，混匀，低温低速离心5 min，弃上清；干燥沉淀，然后用20 μL DEPC水溶解RNA。提取的总RNA于-80 ℃冰箱保存备用，并取3 μL用凝胶电泳来检测提取的RNA质量[11]。

1.3 RT-PCR扩增

以提取的总RNA为模板，在M-MLV反转录酶作用下，用随机引物合成cDNA[12]。再以cDNA为模板，进行PCR扩增，使用50 µL快速PCR反应体系：2×RapidMaster Mix 25 µL、引物CMV-F（10 mmol/L）2 µL、引物CMV-R（10 mmol/ L）2 µL、ddH2O 14 µL、cDNA 2 µL。PCR扩增程序为95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；57 ℃，15 s；72 ℃，30 s；共35个循环；72 ℃，5 min。除扩增引物及退火温度有所变化，下文PCR扩增体系均参照上述体系进行[13]。PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶中电泳检测观察后，参照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收纯化。

将PCR纯化回收产物连接至载体pMD18-T，转化感受态大肠杆菌DH5α，以通用引物M13F/R进行菌落PCR鉴定，鉴定得到的阳性克隆菌液送北京新业擎科公司测序，测序结果与GenBank数据库已登录的序列进行BLAST比对。

2 结果与分析

2.1 田间发病百合症状

发病百合症状如图1所示，发病植株表现为生长不良，萎缩矮小，叶片变黄、畸形、产生黄色斑点及褐色条斑。

图1 田间发病百合

2.2 多重RT-PCR检测

以cDNA为模板，用3对特异性引物CMV-F/R、LMoV-F/R和LSV-F/R进行单重及多重PCR，如图2所示。电泳结果显示，百合病叶分别扩增出657 bp和428 bp 2条片段分别与黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒的片段大小相一致，百合健康叶片cDNA无任何扩增产物。将PCR产物克隆测序后分析表明，克隆得到的CMV CP基因片段与Genbank已登录的CMV CP基因序列（登录号：AAM81374.1）片段同源性为99.08%，LMoV CP基因片段与Genbank已登录的LMoV CP基因序列（登录号：ADO34171.1）片段同源性为98.56%。

3 结论与讨论

目前，在侵染百合的病毒中，CMV、LSV及LMoV为主要流行病毒，我国百合种植基地普遍存在几种病毒复合侵染现象。由于我国百合切花的生产主要依靠进口百合无毒种球，经过二代种球繁育，种植二代种球带毒率高，严重影响百合鲜切花的观赏品质及经济价值。因此，建立并使用多重RT-PCR检测方法十分重要，即便在病毒含量较低时，也能快速准确检测出百合带毒种类。王继华等[1]建立了LMoV与LSV的多重PCR检测技术，整个过程可在6～7 h内完成，相较于常规PCR，大大节约了检测时间。黎昊雁等[7]建立的百合X病毒（LVX）、LSV及LMoV的单一、双重及三重PCR体系检测灵敏度达到了ng级，其中双重PCR大部分可达到pg级，能满足组织内病毒含量不高时病毒检测及尽早检测百合植株是否带毒的需要。徐榕雪等[10]建立了同步检测CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR体系，扩增产物测序结果表明，这3种病毒的CP基因序列地域差异不明显，为高度保守序列。RT-PCR技术检测的特异性及灵敏度均优于免疫学方法，相比于检测方法，这种方法安全可靠、简便迅速。因此，建立多重RT-PCR的病毒检测体系对百合种植基地十分重要。

本试验应用单重及多重RT-PCR方法，参照王冲[9]和徐榕雪[10]合成的3对病毒CP基因特异性引物，对侵染江西省莲花县坊楼镇东边村百合谷的百合的病原进行检测，结果显示该地百合受黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒复合侵染，为当地首次报道。此次检测结果可为江西省莲花县百合种植区病毒流行检测提供技术支持。

[1] 王继华, 王丽花, 元明, 等. 应用多重RT-PCR检测百合无症病毒和百合斑驳病毒[J]. 园艺学报, 2005, 44(2): 284-287.

[2] 刘艳妮, 佘奎军. 百合脱毒技术研究进展[J]. 宁夏农林科技, 2014, 55(8): 10-11.

[3] 刘文洪. 百合病毒的分子鉴定与重要病毒的检测研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2003.

[4] 沈淑琳. 百合病毒病及其检验[J]. 植物检疫, 1996, 18(4): 32-35.

[5] 刘博. 百合、水仙病毒分子检测及脱毒技术研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2009.

[6] 徐秉良, 梁巧兰, 徐琼. 百合病毒病的发生与症状类型[J]. 植物保护, 2004, 42(5): 62-65.

[7] 黎昊雁, 吴姗, 张晓峰, 等. 复合RT-PCR方法同步检测百合X病毒、百合无症病毒及百合斑驳病毒[J]. 植物保护, 2006, 44(6): 42-45.

[8] 白松, 丁元明. 百合病毒病及其检测防治方法[J]. 植物医生, 1996, 11(1): 4-7.

[9] 王冲, 陈集双, 洪健, 等. 以18S rRNA为内参照的多重RT-PCR检测3种百合病毒[J]. 植物病理学报, 2006, 20(3): 204-211.

[10] 徐榕雪. 百合主要病毒的分子检测及脱毒技术研究[D]. 南京: 南京林业大学, 2007.

[11] 张怡, 李豪, 杨松. 一种安全快速提取植物RNA的方法[J]. 生物学教学, 2012, 37(5): 44-45.

[12] 孙晓棠, 崔汝强, 贺浩华, 等. 双重RT-PCR法同时快速检测南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒[J]. 江西农业大学学报, 2012, 34(5): 914-917.

[13] 张磊, 孙晓棠, 唐子清, 等. 水稻基因表达载体及RNAi载体构建[J]. 江西农业大学学报, 2018, 40(1): 10-14.

Molecular Identification of Lily Viruses in Lianhua County, Jiangxi Province

YE Xiaomeng,ZENG Shuai, SHI Xugen, CUI Ruqiang*

(School of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

This study was conducted to detect and identify the viral causing agents that infected lily in Lianhua County, Jiangxi Province.Total RNA were subjected to detect the viruses by using the reported specific primers of 3 main viruses-cucumber mosaic virus (CMV), lily mottle virus (LMoV), and lily syptomless virus (LSV), which were demonstrated by the reverse transcription-PCR (RT-PCR).The primers could be amplified to obtain CMV (657 bp) and LMoV (428 bp) expected for fragments with the same fragment size, but no LSV was detected. Cloning, sequencing and analyses showed that the amplified sequences had 99.08% and 98.56% identities with CMV and LMoV, respectively.In this study, the results suggested that lily was infected by CMV and LMoV.

lily; lily virus disease; multiplex RT-PCR

S432.1

A

2095-3704（2021）02-0146-04

2021-04-20

国家自然科学基金项目（31860494）

叶晓梦（1997—），硕士生，主要从事植物病理学研究，xiaomeng_ye@stu.jxau.edu.cn；*通信作者：崔汝强，教授，博士，cuiruqiang@qq.com。

叶晓梦, 曾帅, 石绪根, 等. 江西省莲花县百合病毒病分子鉴定[J]. 生物灾害科学, 2021, 44(2): 146-149.