汪萌，朱丽霞，张旖旎，李舟，席青松，靳镭

(华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心，武汉 430030)

体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术的出现为无数不孕症夫妇带来了福音。卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术通过将单个精子注射到成熟卵母细胞胞浆中，能有效解决男性因素引起的不孕症，是辅助生殖领域具有重要意义的一项突破性技术[1]。虽然ICSI的操作流程已经标准化，但是如何优化卵母细胞脱颗粒到单精子注射时间，获得更优的妊娠结局仍需要进一步观察和探索[2]。

传统观点认为由于脱颗粒过程中透明质酸酶以及机械吹打会损伤卵母细胞的细胞膜，在脱颗粒操作后卵母细胞需要一段时间来恢复膜结构的稳定性[3]，因此在脱颗粒一段时间后进行单精子注射是合理的。此外，在单精子注射前培养卵母细胞可能会促使胞质进一步成熟，从而使卵母细胞完全激活，获得正常发育的潜能，可能会提高胚胎的受精率和临床妊娠率[4]。但也有研究表明脱颗粒到单精子注射的时间与ICSI受精率负相关[5]，随着时间间隔的延长，ICSI的受精率也会逐渐下降，因此推荐单精子注射应当在脱颗粒后尽快完成。然而还有部分研究认为脱颗粒时间对胚胎发育以及临床结局均无显著影响[6-7]。

由于目前对于脱颗粒后多久进行单精子注射能够获得最优结局尚未达成共识，因此本研究进行了一项回顾性研究，探索卵丘复合物脱颗粒到单精子注射时间对ICSI周期妊娠结局的影响，并试图找到最佳的脱颗粒后ICSI操作时机以获得最优临床结局。

资料与方法

一、研究设计及分组

1.研究对象：本研究为单中心回顾性研究。研究对象为2016年10月至2019年12月于华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心第一次行ICSI治疗的夫妇。

纳入标准为：(1)新鲜采卵周期；(2)男方少、弱精子症且精子优化后密度仍小于5×106/ml；(3)女方无明显异常或仅为输卵管因素性不孕；(4)女方年龄<40岁；(5)女方采用标准改良长方案进行促排卵；(6)获卵数多于4个；(7)男方手淫法取精。

排除标准：(1)供卵或供精周期；(2)男方手术取精(包括睾丸穿刺取精、附睾穿刺取精、显微取精等)；(3)夫妻双方任何一方患有乙肝、结核等感染性疾病；(4)胚胎植入前遗传学检测周期；(5)ICSI后受精失败或低下的周期(受精率<25%)。

本研究已通过华中科技大学同济医学院伦理委员会审核批准。

2.研究对象分组：根据纳入排除标准，本研究共纳入3 827个ICSI周期的数据。将卵丘复合物脱颗粒到单精子注射的时间定义为T，按照四分位数分为T1(T≤120 min，n=1 303)、T2(120 min210 min，n=846)4组。分析比较各组间的受精率、胚胎发育情况和临床妊娠结局。

二、诊疗回顾

1.促排卵方案和取卵：所纳入的周期均采用标准的改良长方案进行促排卵。在取卵周期的月经第2天注射长效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a，达必佳，辉凌，德国)3.75 mg进行降调节，注射药物30 d后进行激素水平检测和经阴道B超监测，达到降调节标准后，使用重组FSH(rFSH，果纳芬，默克雪兰诺，德国)进行促排卵，并根据卵泡监测的结果调整用药剂量。当经阴道B超监测有2个或以上优势卵泡直径大于18 mm时，肌肉注射重组HCG(艾泽，默克雪兰诺，德国)10 000 U，36～38 h后经阴道超声下取卵。

2.卵丘复合物脱颗粒操作：配制80 U/ml的透明质酸酶，将卵丘复合物置于预热好的透明质酸酶中，反复轻轻吹打，使颗粒细胞松散后，将卵母细胞移至G-MOPS plus缓冲液(Vitrolife，瑞典)中机械法继续吹打去除卵丘颗粒细胞，直至完全去除颗粒细胞；再将去除了卵丘颗粒细胞的卵母细胞转移到G1 plus培养液(Vitrolife，瑞典)中继续培养。

3.ICSI操作：将优化处理后的精子加到PVP溶液(Vitrolife，瑞典)中，调节操作针，在镜下需选择形态正常，特别是头部形态正常的直线前向运动精子(长约60 μm，头部呈卵圆形，长约4～5 μm)。将待注射的精子制动后，将制动的精子从尾部吸入注射针内；用显微固定针固定卵子，使卵子极体位于12点或6点位置；将精子推至注射针尖端，于3点位置将注射针垂直穿透透明带及卵子胞膜进入胞浆，回吸可见卵膜破裂，部分胞浆和精子回流，随后将回吸的胞浆与精子一起缓慢注入卵母细胞，尽可能减少PVP的注入量，最后退出操作针。

4.胚胎培养及形态学评估：ICSI注射结束后的卵子在培养液中充分冲洗后移到预先平衡的G1 plus培养液中放回培养箱继续培养。授精后16～18 h(D1)在倒置显微镜下评估原核(pronuclei，PN)，能观察到两个原核(2PN)并在卵周隙中有两个极体则说明正常受精，记录各个卵子的PN数目。正常受精的卵子继续培养至第3天(D3)，分别于D2、D3观察并记录胚胎的卵裂情况(包括卵裂球数目、形态、均匀程度、碎片情况)。第3天选择优质胚胎进行移植，剩余可利用胚胎转移至G2 plus培养液(Vitrolife，瑞典)中继续培养至囊胚阶段，优质囊胚进行冷冻保存。

5.临床结局[8-9]：本研究纳入的所有移植周期均为D3新鲜胚胎移植周期。胚胎移植后14 d进行血清HCG检测。胚胎移植5周后在超声下能观察到子宫内孕囊及活动胎心则定义为临床妊娠；确认临床妊娠后20周内失去胎心则定义为流产；生化妊娠定义为HCG阳性但B超未见孕囊及胎心搏动。

三、评估指标及定义

患者基线数据；IVF评估指标，包括获卵数、MⅡ率、2PN率、多PN率和卵裂率；妊娠结局评估指标，包括生化妊娠率、临床妊娠率、流产率和种植率。

各指数的计算方式如下：MⅡ卵率=MⅡ卵总数/获卵数×100%；2PN率=D1出现2PN的卵总数/ MⅡ卵总数×100%；多PN率=D1出现多PN的卵总数/ MⅡ卵总数×100%；卵裂率=卵裂胚胎总数/D1出现PN的卵总数×100%；生化妊娠率=生化妊娠周期数/移植周期数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%；种植率=孕囊个数/移植总胚胎数×100%。

四、统计学分析

结 果

一、研究对象的临床特征基线比较

本研究共纳入2016年10月至2019年12月第1次于本中心行ICSI治疗的3 827个周期。卵丘复合物脱颗粒到单精子注射时间T(min)的范围为(0～450)min，呈偏态分布；众数为120 min，中位数为160 min，四分位数分别为120 min、160 min和210 min。根据T值大小分为T1(T≤120 min)、T2(120 min210 min)4组。其中T1组1 303个周期，T2组641个周期，T3组1 037个周期，T4组846个周期。

纳入的患者临床特征包括年龄、体质量指数(BMI)、基础FSH水平、基础窦卵泡数、不孕年限及采卵到脱颗粒时间，各组间均无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 患者临床特征基线数据(-±s)

二、各组患者的ICSI结果比较

本研究比较了不同组患者的获卵数、MⅡ率、正常受精率(2PN率)、多PN率以及卵裂率。各组间获卵数以及卵裂率比较均无显著差异(P>0.05)。随着脱颗粒到单精子注射时间T的逐步延长，MⅡ率逐步升高，正常受精率也逐渐增加；其中T1组的MⅡ卵率相较于T4组显著降低(P<0.05)，且T1组的2PN率相较于其他3组也显著降低(P<0.05)。此外，随着T时间的延长，多PN率也呈现上升趋势，T3组相较于T1组的多PN率显著升高(P<0.05)(表2)。

表2 各组患者ICSI结果比较[(-±s)，%]

三、各组患者的妊娠结局比较

本研究统计了新鲜移植周期的妊娠结局，主要妊娠结局包括生化妊娠率、临床妊娠率、种植率和流产率。纳入的3 827个ICSI周期中，共有2 427个周期进行了D3新鲜周期胚胎移植，其中T1组838个周期、T2组393个周期、T3组642个周期、T4组554个周期。各组在单周期移植胚胎数目上无显著差异(P>0.05)，且生化妊娠率、临床妊娠率、流产率比较均无显著差异(P>0.05)。但是T1组的种植率显著高于T3组(P<0.05)(表3)，提示脱颗粒到单精子注射时间过长可能会影响胚胎的种植潜能。

表3 新鲜周期移植的临床结局比较[(-±s)，%]

讨 论

ICSI技术作为一种新型的体外受精技术主要用于男性因素不育或传统IVF受精失败患者。卵丘复合物脱颗粒以及单精子注射是ICSI操作中至关重要的步骤，对最终的临床妊娠结局有着重要影响。但如何控制脱颗粒到单精子注射时间以获得最优临床结局目前尚无统一定论。本研究回顾性分析了脱颗粒到单精子注射时间对ICSI周期妊娠结局的影响，结果发现卵丘复合物脱颗粒到单精子注射时间会影响胚胎的种植潜能，合理地把握ICSI操作时机有利于提高胚胎种植机会，优化IVF助孕结局。

本研究根据脱颗粒到单精子注射时间间隔，将纳入人群分为4组，主要评估指标为IVF结果以及临床妊娠结局。IVF结果提示随着脱颗粒到单精子注射时间间隔不断延长，正常受精率(2PN率)也逐渐升高，这一结果与最近一项大样本研究报道[3]一致，该研究中纳入了1 468个ICSI周期，发现脱颗粒到单精子注射时间间隔与正常受精率之间存在正相关。造成这种现象的原因可能与卵母细胞的胞浆成熟相关。有文献报道小鼠卵母细胞的核与胞浆的发育和成熟是不同步的，颗粒细胞会影响卵母细胞胞浆的成熟[10]，如果在卵母细胞胞浆成熟前进行ICSI，可能无法恢复减数分裂过程，从而无法形成原核导致受精失败。然而，在正常生理条件下，排卵后的卵母细胞长时间不受精，卵母细胞的质量会呈现时间依赖性的下降，表现为“卵母细胞老化”，这也是造成IVF/ICSI周期中胚胎发育潜能下降的最常见原因之一[11-12]。本研究结果也提示，脱颗粒到单精子注射时间间隔越长，胚胎的异常受精率(多PN率)也会逐渐上升。异常受精率上升也是卵母细胞老化的一种表现，是由于老化的卵母细胞在进行分裂时染色体滞留增加所致[13]。因此脱颗粒到单精子注射时间间隔过长或过短均不利于胚胎的发育。此外，本研究结果发现随着脱颗粒到单精子注射时间的延长，卵母细胞的MⅡ卵率也逐渐增加，这可能与单精子注射时间越晚，卵母细胞体外培养时间延长，部分处于MI期的卵母细胞可能在体外成熟，导致卵母细胞成熟率增高有关。

本研究将胚胎的妊娠结局作为主要结局指标，发现各组在生化妊娠率、临床妊娠率和流产率上并无统计学差异(P>0.05)。但有趣的是，虽然随着脱颗粒到单精子注射时间间隔的延长，受精率逐渐升高，但是胚胎的种植率反而下降。原因可能正如前文所述，如果卵母细胞没有在一个合适的时间段内受精，卵母细胞会继续在输卵管或者培养液中停留，从而发生卵母细胞老化最终影响卵母细胞的发育潜能[14]；老化的卵母细胞会影响卵母细胞成熟相关因子的表达，从而最终影响后期胚胎的发育与种植潜能[15]。

本研究根据脱颗粒到单精子注射时间间隔(T)的四分位数，将各组进行对比，结果发现相较于其他组，T1组(T≤120 min)的胚胎种植率显著升高，提示如果控制此时间间隔在2 h以内，可能有助于胚胎的着床。时间间隔越长，胚胎的种植能力可能会受损。Boldi等[16]发现将时间间隔控制在1 h以内能获得更高的优质胚胎率、种植率和妊娠率。Zhang等[17]也发现将时间间隔控制在4 h以内会获得更好的临床妊娠率。虽然本研究结论与这些结果大体上一致，但是脱颗粒细胞后进行单精子注射的最佳时间各研究仍不统一。本研究的结果显示在卵母细胞脱颗粒后孵育一段时间后应该尽快完成单精子注射操作，以获得更好的妊娠结局。

本研究仍存在不足之处。首先本研究是一个单中心的回顾性研究，样本量也有限；其次虽然各组移植胚胎数没有显著差异，但是单胚胎移植和双胚胎移植的临床结局可能会存在差异；另外本研究仅关注了脱颗粒到单精子注射这一段时间，而采卵到脱颗粒的时间也有可能对结果造成一定的影响。后续需要多中心、大样本、前瞻性研究来验证结果的准确性。

综上所述，在ICSI周期中卵丘复合物脱颗粒到单精子注射时间可能会影响胚胎的种植潜能，合理地把握ICSI操作时机有利于提高胚胎种植机会，优化IVF助孕结局。