李春杰，郎鸣晓，陈振江，王正凤，陈泰祥

（兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室，兰州大学草地农业教育部工程研究中心，兰州大学甘肃省西部草业技术创新中心，兰州大学草地微生物研究中心，兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州730020）

禾草内生真菌（grass fungal endophyte）是指在宿主禾草中度过部分或全部生命周期，而对禾草本身不引起任何外部症状的一类真菌［1］。现在研究较多的禾草内生真菌是子囊菌门（Asomycota）麦角菌科（Clavicipitaceae）的有性世代Epichloë属内生真菌及其所对应无性世代Neotyphodium属，2014 年，Leuchtmann 等［2］将这两种属的内生真菌统一归总为Epichloë属。目前，在全球范围内已发现80 个属300 多种禾草中存在有内生真菌［3−4］。一方面，禾草内生真菌共生体能够产生对家畜有毒的生物碱，给畜牧业发展带来巨大阻碍和经济损失；但另一方面，禾草内生真菌共生对宿主和内生真菌皆有利：内生真菌从宿主植物体内获取自身所需营养、进行繁殖，并通过宿主植物传播，而内生真菌往往能够提高宿主植物对干旱［5］、盐碱［6］、重金属［7］、寒冷［8］和水涝［9］等非生物胁迫的耐受性和抵抗昆虫［10］、病原菌［11−13］、线虫［14］等生物胁迫的能力，部分内生真菌还能够用于生物防治［15］、生成生长激素，以促进宿主植物生长和发育［16］，提高植物的竞争能力［17］和维持生态系统平衡［18］；同时，共生体产生的有毒生物碱能够使家畜中毒，在一定程度上能够减少草食动物的采食进而保护禾草［19］。内生真菌在植物中分布十分广泛，其宿主植物包括草本、灌木、乔木及藻类等，尤其在禾本科植物中分布最多［20］。内生真菌在畜牧业和农业上都有很大的经济价值和应用潜力［21］，然而，自然界中大多数禾草只能被一种内生真菌所侵染，仅有一小部分内生真菌可与多个宿主共生或宿主可与多种内生真菌共生［22］。研究发现，同一种内生真菌与同种宿主的不同品种共生，其对两个不同品种宿主植物的影响有差异［23］（表1）。同时，野生禾草相较于被驯化的禾草，其内生真菌的侵染与定殖不稳定，受生长环境、宿主特性、生长年限等因素影响［24−26］，这都使得禾草−内生真菌共生体优良性状的应用与推广受到限制。由于禾本科植物内生真菌的宿主特异性，以及人工接种过程操作要求高，同时还需破坏植物组织而导致宿主死亡率高，使得人工接种成功率较低。1985 年Latch 等［27］用无菌苗转接法成功接种禾草，研究不同宿主与不同内生真菌种类组合以及不同接种方法等因素对接种成功率的综合影响，使禾草内生真菌人工接种方法逐步建立起来。

表1 不同禾草-内生真菌组合人工接种结果Table 1 Artificial inoculation results of different grass-endophytic fungi combinations

禾草内生真菌人工接种最常见的方法是切口法和注射法，但这两种方法的缺点是可对禾草植株造成一定的物理伤害而导致植株尤其是幼苗死亡率高。种子浸菌法和种子伤口法需要在种子上造成一定的创口，再将菌悬液或菌丝接入创口内，两种接种方法更适用于接种无性繁殖的内生真菌。愈伤组织接种法可供选择的外植体较多：茎节、花穗、花序、幼穗、未成熟胚及成熟种子均可作为材料［28−30］，但该技术的缺点是在禾本科植物上应用相对困难，一是因为禾本科植物的组织培养再生对基因型有较强的依赖，其胚性愈伤组织再生率低；二是禾本科植物组织培养再生体系不够完善，成熟的组织培养再生体系并不一定适用于禾本科植物；三是禾本科植物组培常用成熟种子（胚）作为外植体，其诱导的胚性愈伤组织比例低，且需要继代培养，所需周期长，又会使愈伤组织分化率降低［31］。在禾草组织培养再生体系全面建立的前提下，愈伤组织接种法的潜在成功率相对较高。成株接种法适用于已经生长健壮的成株植物，健壮植株的抵抗力较好，对其造成物理伤害不易死亡，但缺点是由于成株具有较强抵抗外来真菌的能力而使该方法接种成功率较低（表2）。

表2 不同接种方法操作步骤及接种成功率Table 2 Different inoculation methods and inoculation rate

续表1 Continued Table 1

本研究对国内外禾草内生真菌人工接种方法进行综述，为建立创新人工接种技术，选择合适的接种手段，充分利用内生真菌资源，构建优良禾草内生真菌共生体，以消除自然界内共生体的局限性，扩大内生真菌在禾草中的共生范围，为创制新的禾草内生真菌共生体种质资源提供理论基础和科学依据。

1 无菌苗接种法

禾草内生真菌人工接种方法研究初期，多以无菌苗为试验材料，主要有两种接种方法：将菌丝体置于无菌苗特定部位和伤口部位进行培养，其伤口部位多在无菌苗胚芽鞘和中胚轴之间。伤口接种法是事先在无菌苗特定部位切开伤口，将培养好的真菌菌丝放入其中，于适宜条件下培养幼苗。研究发现，将菌丝接入无菌苗伤口的接种效果远好于直接将菌丝体放在无菌苗组织上［27］。最早国际知名的内生真菌学专家Latch 等［27］以多年生黑麦草（L. perenne）、高羊茅（F. arundinacea）和紫羊茅（F. rubra）为研究对象，从无内生真菌共生的植物中获取不带内生真菌的种子，消毒后在无菌条件下培养得到无菌苗，将培养得到的真菌菌丝体用以下3 种方法接入幼苗：1）直接在无菌苗中胚轴及胚芽鞘交界处放置菌丝体；2）在无菌苗中胚轴及胚芽鞘交界处切一个3～5 mm 的纵向切口，并取出切口植物组织，将菌丝体放入；3）在无菌苗中胚轴及胚芽鞘交界处切一个3～5 mm 的纵向切口，将菌丝体直接接入。经检测，该试验总的接种成功率为10.8%，对植物不同的处理方式也直接影响到幼苗接种成功率。我国第一次采用幼苗切口法将内生真菌接入高羊茅和多年生黑麦草，得到成功接种的禾草内生真菌共生体，但其接种率较低，不同组合的接种效率分别为0.94%和1.00%［21］。将Epichloë属内生真菌参考Latch 等［27］的方法导入小麦（T. aestivum）、大麦（H. vulgare）和黑麦（Secale cereale）中，结果仅在黑麦和小麦接种成功，但发现感染了内生真菌的植株出现了发育不良或矮化的症状［23］，由此可见内生真菌对亲缘关系不同的宿主植物有不同的影响。2015 年，陈丽［32］将甘肃内生真菌（E. gansuensis）用无菌苗接种法接入醉马草（A. inebrians）无菌苗中，获得了比较高的接种率，为21%。王正凤［33］将E. bromicola内生真菌接入大麦无菌苗中，得到侵染率为2%的新共生体，这是国内首次将禾草内生真菌接入作物大麦中，为今后禾谷类作物的种质创新提供新的研究方向。无菌苗伤口接种法操作简单，但此方法的缺点是对幼苗产生的物理伤害往往会造成幼苗高死亡率，且不适用于相对细弱的幼苗和成熟组织。总之，无菌苗接种法仍是目前应用最为普遍的接种方法。

2 注射接种法

注射法常以幼苗为对象，取内生真菌菌丝制成菌悬液或直接将菌丝随无菌水一同注入幼苗内以侵染植株，其注射部位通常为幼苗茎基部分生区［34］和幼苗生长点［35］。将扁芒草属（Danthoniasp.）、针茅属（Stipasp.）和洋狗尾草属（Cynosurussp.）种子消毒后在无菌条件下培育成幼苗，待幼苗培育好后，用无菌注射器将菌丝体或分生孢子随无菌水注入幼苗分生组织上方中，经检测，接种成功率为0～100%。该试验接种成功率差异较大，其结果与宿主及内生真菌是否兼容有极大关联，同时，接种成功率与接种时幼苗的年龄密切相关，且接种后菌丝的定殖环境对接种成功率也有影响［36］。用从羊茅中分离出的E. typhina内生真菌制成菌悬液注射侵染5 种高羊茅商业品种，得到总接种成功率为2.5%［35］。注射法的缺点是其操作过程较为繁琐，接种过程中技术要求和环境条件较高，但通过试验，发现注射法相较于种子浸菌法侵染率更高［35］。建议在进行无菌苗接种法和注射接种法之前做足够的预试验，待充分掌握此两种技术后再进行后续大量接种。

3 种子接种法

3.1 种子浸菌法

Epichloë内生真菌菌丝在宿主植物中的侵染过程为先侵入芽原基，而后侵入花原基，并随着花原基发育为小花最后侵染进入种子，并通过种子进行垂直传播［33］。因此，Epichloë内生真菌可通过菌丝接种于种子进行侵染。将不含内生真菌的高羊茅种子消毒处理后剪破，置于含有菌悬液的培养皿或锥形瓶中封口培养，并按时浇灌菌悬液，其接种成功率为2.1%。注射法和种子浸菌法都是将菌悬液导入植株体内［35］，与注射法相比，种子浸菌法操作简便，但该方法的缺点是需要破坏种子，虽利于菌丝侵入，却同时破坏了种子结构，影响了种子正常生长发育，降低了种子的存活率，进而导致菌丝体在种子发芽生长过程中难以进入幼苗而继续正常生长。

3.2 种子伤口法

种子伤口法是直接使菌丝体生长进种子伤口的方法。通过尝试试验，在消毒后的多年生黑麦草、高羊茅和冰草（Agropyron cristatum）种子胚部剪一小口，将内生真菌菌丝接入伤口，最终种子成活率低且成活的接种苗均未被感染［21］。发明专利表明，用无菌的接种针刺穿消过毒的种子，将刺穿的种子放在有内生真菌菌落的培养瓶中继续培养［37］。种子接种法的优点是其接种周期短，且操作要求较低［37］，但缺点在于该方法是一种新的人工接种技术的尝试，目前接种成功率并不高，需要在接下来的试验中探索该方法的可行性。在要求高接种成功率的同时，还要保证种子发芽率和幼苗成活率。

4 愈伤组织接种法

组织培养是指在无菌环境中，以植物组织为材料进行人工培养，获得再生完整植株的技术，是利用愈伤组织人工接种法培育禾草内生真菌共生体的首要条件［21］。胚和幼苗是植物生命周期中内生真菌自然侵入的唯一阶段，因此，许多学者试图在体外模拟这一过程［38］。愈伤组织接种法需要经过愈伤组织的诱导、分化、生根和再生等过程，其中，诱导和分化是关键步骤，且愈伤组织的诱导率和分化率与外植体类型、植物基因型、培养基种类以及培养基中激素浓度及比例有关［39］，不同的外植体最佳激素浓度不同，以幼穗和未成熟胚为外植体诱导的愈伤组织分化率高于茎和花序，且出愈率高于成熟种子，但其取材易受时空条件限制，而由成熟种子为外植体诱导的愈伤组织植物再生频率高且取材方便，因此成为诱导愈伤组织的理想材料［30］。Johnson 等［40］研究发现，将E.coenophiala接入高羊茅由花梗诱导出的愈伤组织中，最终得到侵染成功率为17%的高羊茅内生真菌共生体，同时在新的共生体中检测到了生物碱的积累。用E. coenophiala侵染高羊茅，发现内生真菌接种在体细胞胚上得到最高的侵染率为5%［38］。国内首次将E. typhina、E. coenophiala和Epochloësp. 内生真菌接入由禾本科植物：多年生黑麦草、高羊茅和翦股颖（Agrostis stolonifera）的种子和胚为外植体所诱导的愈伤组织中。当愈伤组织上出现黄绿色幼芽，将内生真菌菌丝制成的孢子悬液接入分化芽切口，再进行培养得到共生体，不同组合的接种效率分别为3.6%、3.6%和7.9%，并通过分离培养验证得到了新的多年生黑麦草−E. typhina共生体［21］。与无菌苗转接法相比，愈伤组织法的缺点在于操作更为繁琐，周期长且制作成本高。但该方法的优点是不受季节和地理位置的限制［41］，有研究者通过试验对比愈伤组织和伤口法的接种成功率，发现愈伤组织法接种的幼苗更易受到内生真菌的侵染［21］，且选用成熟胚作为外植体的愈伤组织诱导效果好于种子［42−43］。提高愈伤组织接种的成功率，要提高愈伤组织诱导率和分化率，在操作过程中减少愈伤组织的感染，优化再生植株的生长条件［21］（表3）。

表3 不同植物及外植体诱导愈伤组织所需激素浓度Table 3 Hormone concentration required for callus induction in different plant species and explants

5 成株接种法

成株接种法是将菌丝体或菌悬液直接塞入或注入事先在成株基部切好的伤口中进行培养。研究者将内生真菌菌丝接入或注射于黑麦草成熟分蘖基部［27］，以及将菌丝塞入事先在生长健壮的成株高羊茅基部划开的伤口中进行培养［35］，结果发现这两项试验均未获得成功感染的植株。该方法在使用时需要选取健壮的禾草植株，且在基部的伤口不可过深，在试验过程中注意保持植株的直立状态，避免其出现倒伏。南开大学高玉葆课题组用成株分蘖转接法接种高羊茅，得到接种成功率为3%的高羊茅内生真菌共生体［33］。成株接种法缺点在于成熟植株伤口较大，病菌容易侵入而影响植株的正常生长，而且健壮的植株自身具备抵御外源菌侵入的能力，塞入切口中的菌丝体很难定殖［35］，但相较于无菌苗接种法，该方法的优点在于可应用于成熟的禾草植株，且接种条件要求较低。

6 展望

我国幅员辽阔，地大物博，有着丰富的植物物种资源，其中包括超过225 个属近1200 个种的禾本科植物［50］，且目前已在全世界范围内发现至少80 个属300 余种禾本科植物带有内生真菌［33］，在我国，早熟禾属（Poa）、羊茅属、披碱草属（Elymus）等21 属77 种禾草植物中发现Epichloë内生真菌［51］。研究发现，禾草与内生真菌共生能够在其品质、产量、抗性等方面发挥积极作用，因此，利用内生真菌对禾草进行种质创新是近年来国际草业领域的发展趋势［52］。关于内生真菌对寄主禾草的生长发育、品质及抗逆性影响的研究很多，但由于内生真菌的宿主特异性，其对宿主的良性影响并不能在多种禾草上体现，新西兰学者尝试用人工接种技术将从小麦族植物分离出的内生真菌接入小麦、大麦和黑麦等麦类作物中，发现不同宿主基因型对内生真菌侵染的效应存在差异［23］。内生真菌具有双重特性，通过在内生真菌菌种资源中筛选对家畜不产生有毒物质及提高宿主抗性等具有优良特性的菌株，并利用人工接种技术建立新的高产优质、抗逆无毒的禾草−内生真菌共生体，在提高禾草产量、品质、确保人类及家畜食用安全性方面有重要意义［53］。

在国际学术界，关于禾草内生真菌人工接种技术的研究并不多，且成功的人工接种技术受专利保护［52］。而关于内生真菌与非禾本科植物的接种技术及禾草与病原菌［54−55］、菌根真菌［56−57］的接种技术研究较多，但这两方面的接种技术并不完全适用于共生真菌接种禾本科植物。在许多研究中，用不同内生真菌接种禾草，禾草未必能够被所有真菌侵染，这不仅仅是由于宿主特异性的影响，在接种方式的选择、宿主植物基因型、内生真菌基因型、植物组织类型、宿主处理方式及后续培养条件等方面对接种成功率都有极大的影响。目前，国内外针对禾草的人工接种方法，主要是以无菌苗、愈伤组织、种子及成株为材料的方式。无菌苗接种法和注射接种法在目前研究中广泛使用，其操作简便高效，适用于大批量接种，但其缺点在于操作过程需对幼苗造成伤口，易被其他病原菌感染，且幼苗较弱易死亡；愈伤组织接种法优点在于成功率相对较高，而缺点是需建立成熟的组织培养再生体系，目前只有少数禾草建立起完整的组织培养再生体系，故该方法的应用具有较大局限性；以种子为材料进行的人工接种方法如种子伤口法和种子浸菌法，是基于内生真菌能够通过垂直传播直接进入植物地上部，因而是人工接种技术创新的一个重要方向；种子浸菌法优点是在内生细菌、病原菌、内生真菌接种方面都有很好的应用，且其宿主植物不局限于禾草，但该方法的缺点是接种过程中可能由于破坏种子结构而造成种子失活，同时其侵染率往往低于无菌苗接种法，故此方法在试验研究中应用较多，而实际生产操作中推广不足；以成株为材料的接种方法和种子接种法目前在试验阶段，接种成功率尚且不高，在实际操作中并未广泛使用。学者们提出并尝试了愈伤组织与内生真菌共培养的接种新方法，在不伤害植物组织的前提下，使内生真菌与植物自然共生，但尚未成功，方法还正在优化中。

针对人工接种技术对试验材料的破坏及在培养过程中易受到杂菌污染导致接种成功率低等问题，应当通过大量试验操作，对不同禾草品种建立起最适接种条件和接种操作要求，在保证接种成功率的同时要尽量简化接种步骤，以便进一步在实际生产中推广应用。对于尚在试验阶段的人工接种技术，应当分析试验材料生理特点与试验操作技术在科学性和操作性方面是否切实可行。近年来，分子生物技术和基因组学研究发展迅速，对内生真菌的系统研究也有了很大的促进作用。新一代测序技术，如全基因组测序技术的应用，对内生真菌生物碱合成相关基因的探索分析，为了解寄主与真菌相互作用的基因表达奠定了基础［58］。美国肯塔基大学Christopher Schardl 教授和澳大利亚维多利亚农业生物研究中心German Spangenberg 教授在实验室相继完成了对不同禾草内生真菌的全基因组测序，使全球的科学家能够共同探索影响真菌与宿主关系的相关基因［59−61］。因此，应进一步借助分子生物学手段解决内生真菌与宿主的遗传稳定性和相容性差的问题，为禾草内生真菌共生体的研究提供更多理论支持。总之，不同领域的研究与技术相互融合，更加系统和完善的新技术与新发现都将应用于禾草内生真菌人工接种技术中，为创建新的禾草内生真菌共生体提供理论依据。

随着禾草内生真菌共生体建立与功能等领域研究的不断深入，接种的内生真菌在禾草子代中稳定遗传成为一大研究趋势。结合现有接种和生物工程技术，建立能在禾本科植物中稳定遗传的禾草内生真菌共生体的人工接种方法势在必行。研究发现内生真菌基因组中带有能使家畜等其他动物中毒的基因，这为禾草内生真菌新共生体的建立带来新的问题，新共生体的建立不应只局限于高接种成功率这层次，应当深入到内生真菌产碱基因中，研究产碱基因的表达及调控机理，分析其对家畜、生态环境甚至人类的潜在危险，并进行风险评估，以期获得最有利于人类及生态环境的真菌与植物资源。现有的内生真菌接种方法只能针对内生真菌对宿主是否能够侵染及兼容，并不能准确判断内生真菌对宿主的影响。目前，新接种方法研究的不断发展为禾草内生真菌人工接种技术提供了更多启示。因此，应结合传统与新开发的人工接种技术，针对禾草植株的外部形态、物种特异性、受体组织类型及其生长状态，建立适用于不同禾草和内生真菌的技术手段进行人工接种，这样才能更好更快地建立目标共生体，创制优异种质，培育抗逆的优良品种。