吴国芳，于肖夏，于卓，杨东升，卢倩倩

（内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特010019）

高丹草（Sorghum bicolor×Sorghum sudanense）为高粱（Sorghum bicolor）与苏丹草（Sorghum sudanense）种间杂交育成的品种（2n=2x=20）［1−2］。其具有生长速度快、分蘖数多、再生性强、抗寒、抗旱、耐倒伏、产草量高、品质好等优点［3−5］，可多次青刈饲喂家畜，亦可青贮及调制优质青干草，是我国农区及半农半牧区养殖业发展的重要一年生优良饲草［6］。但幼嫩的高丹草含有一定量的氢氰酸，家畜采食过量后，可引起中毒现象［7−9］。因此，急需培育低氢氰酸含量、饲喂家畜安全的高丹草新品种。

简单重复序列（simple sequence repeats，SSR），亦称微卫星DNA 标记，其均匀分布在植物基因组中［10］。SSR标记呈共显性遗传，可鉴别纯合子和杂合子、多态性好、对DNA 质量要求不高且用量少，目前已成功应用于作物品种鉴定、遗传图谱构建、重要性状QTL 定位及标记辅助育种等研究［11−14］。群体分离分析法（bulked segregation analysis，BSA）即DNA 混池法，由Michelmore 等［15］1991 年首次提出。该方法是利用具有一定表型差异的亲本杂交产生后代分离群体单株，建立具有目标性状的两个极端DNA 基因池，进行相关性状的分子标记筛选，若在2 个极端DNA 基因池之间存在一定的多态性分子标记差异，则表明该标记与目标性状基因呈连锁遗传［16］。目前，国内外学者将BSA 法与SSR 分子标记相结合，已成功应用于小麦（Triticum aestivum）根部线虫抗性基因片段［17］及水稻（Oryza sativa）叶枯病［18］、甘蔗（Saccharum officinarum）褐锈病［19］、高粱粒重［20］等性状的基因片段筛选，而在高丹草低氢氰酸含量性状相关基因片段的筛选尚未见有研究报道。

本课题组前期以氢氰酸含量较高的散穗高粱（scattered ear sorghum）作母本，氢氰酸含量较低的红壳苏丹草（red hull sudangrass）作父本，通过人工去雄杂交成功获得高丹草F1代植株，进而将F1代套袋自交获得F2代分离群体［21−22］。本试验以高丹草F2分离单株群体及其亲本为材料，通过测定氢氰酸含量筛选出高氢氰酸含量植株和低氢氰酸含量植株，构建DNA 基因池，利用BSA−SSR 法筛选与高丹草低氢氰酸含量性状相关的SSR−DNA 目的片段，并对其进行回收、纯化和测序，以期鉴定出高丹草低氢氰酸含量性状的相关基因片段，为下一步低氢氰酸性状主效QTL 精细定位、基因图位克隆及其功能解析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料及种植

材料为高丹草F2分离群体及其亲本散穗高粱和红壳苏丹草。2020 年5 月种植在内蒙古农业大学农场，行距为50 cm，株距为25 cm。生长期内根据生长状况及时施肥、灌水，保证植株对养分和水分的需求，并注意防除田间杂草。

1.2 研究方法

1.2.1 氢氰酸含量测定 在高丹草拔节期，株高约为100 cm 时，田间剪取F2代500 个分离单株及亲本的新鲜茎叶，按单株用微型粉碎器粉碎混匀，每个样品分别称取1.0 g，放入装有8 滴甲基橙、10 mL 硝酸锌和270 mL 蒸馏水的500 mL 蒸馏瓶中加热蒸馏。用装有10 mL 1.0% NaOH 吸收液的100 mL 容量瓶收集馏出液，当容量瓶中的馏出液为100 mL 时，蒸馏结束。吸取10 mL 馏出液放入25 mL 容量瓶中，加入5 mL 磷酸盐缓冲液和4 滴1.0%的氯胺T，充分摇匀3 min，然后加入5 mL 异烟酸−吡唑啉酮比色酸（5∶1 混合物）进行显色处理［23］，用日本岛津公司产紫外分光光度计UV-1800 在636.5 nm 处比色测定样液的吸光度值y，每个样品重复测定3 次。以CN−浓度（μg·mL−1）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程y=0.1078x−0.0019（R2=0.9999）。方程中y为吸光度，x为 CN−的质量浓度，计量单位换算成 mg·kg−1FW［7］。

1.2.2 DNA 提取与DNA−BSA 混池建立 本试验用植物基因组DNA 提取试剂盒提取F2低氢氰酸含量（＜15 mg·kg−1FW，简称低氰）和高氢氰酸含量（＞300 mg·kg−1FW，简称高氰）的极端单株各10 株及母本散穗高粱和父本红壳苏丹草的DNA。从极端株中各吸取5 μL 的DNA 进行等量混合，形成低氰基因池和高氰基因池。

1.2.3 SSR 引物设计与PCR 扩增 试验所用70 对SSR 引物是根据已公布的高粱基因组EST 序列，借助SSR Hunter 软件查找SSR 位点，利用Primer 5 软件设计出SSR 引物序列，委托南京金瑞斯生物科技有限公司合成。

PCR 反应体系总体积为 20 μL。其中含 Mg2+的 10×buffer 2.0 μL，2.5 mmol·L−1的 dNTP 1.5 μL，5 U·μL−1的Taq-poLymerase 0.2 μL，10 ng·μL−1上下游引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2O 补足 20 μL。

PCR 扩增程序：循环前 94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，38 个循环。循环后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 反应结束后，加入 5.0 μL 变性剂，95 ℃变性 5 min，迅速取出在冰上冷却，置于−20 ℃条件下保存备用。

1.2.4 电泳及胶板银染 将上述PCR 变性后的样品取5 μL，用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR 产物的质量。电泳缓冲液为1×TBE，恒定功率70 W，电泳时长1.2 h。电泳后对胶板进行银染，参照李建武等［24］的染色方法。

1.2.5 低氰DNA 目的片段的回收与纯化 以母本散穗高粱SSR−DNA 片段为高氰参比，以红壳苏丹草SSR−DNA 片段为低氰参比，用100 bp 的LadderDNA 作Marker，在电泳胶板上找出低氢氰酸含量的DNA 片段进行回收。在聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上分别用无菌手术刀将不同SSR 引物扩增出的单一低氰目的片段条带切下，置1.5 mL 离心管中，加入0.2 mL ddH2O，用枪头将胶块充分碾碎，加盖后将离心管置入100 ℃沸水中加热10 min，释放凝胶内的DNA。冷却2 min 后，4 ℃下12000 r·min−1离心5 min，吸取上清液转入新的离心管中。

1）低氰目的片段二次PCR 扩增及电泳检测。将以上得到的上清液用原PCR 体系和程序进行再次扩增，产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测（电压120 V，电泳25 min）。若电泳结果显示清晰的单一条带，且分子量大小与聚丙烯酰胺凝胶中的低氰条带相对应，则表明回收质量较好；若琼脂糖凝胶电泳检测结果显示的条带在2 条以上，则表明目的片段回收质量较差，需进一步纯化。

2）目的片段纯化。用索莱宝公司生产的PCR 产物纯化试剂盒，依据说明书对2 条以上低氰目的片段的DNA进行纯化。

3）目的片段命名。采用目的片段（target fragment）的英文缩写“TF”+“片段数目”，如TF1。

1.2.6 纯化DNA 检测 吸取纯化得到的DNA 片段溶液5 μL，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，若低氰DNA 目的片段呈清晰单一条带，则达到测序要求。

1.2.7 低氰DNA 目的片段的测序及序列比对 委托上海生物工程股份有限公司对筛选出的高丹草低氰DNA 目的片段进行测序。将测序获得的低氰目的片段序列，与GenBank（http//：www. ncbi. nLm. nih. gov/BLAST/）和高粱基因组数据库V3.1.1（http：//www.gramene.org/Sorghum_bicolor/Location）进行同源性比对分析。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA 的纯度检测

将提取后的各供试材料基因组DNA 用紫外分光光度计在不同吸光度（OD）下检测结果显示，OD260/OD280均在1.80～2.00 范围内，说明所提取的DNA 浓度适宜。进而用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，各样品电泳条带清晰稳定，无拖尾降解现象（图1），表明DNA 纯度高，完全能满足SSR 分子标记试验的要求。

图1 高丹草F2部分单株基因组DNA 电泳检测Fig.1 Sorghum-sudangrass hybrids of F2 plants genomic DNA electrophoresis results

2.2 高丹草F2 BSA 混池及其亲本DNA 扩增

用70 对SSR 引物对F2的高氰和低氰植株基因池及亲本DNA 进行PCR 扩增及电泳检测结果表明，70 对引物中有9 对引物（表1）可以区分高氰、低氰性状（在高氰中无SSR 条带，在低氰中有明显的SSR 条带）。9 对引物中，筛选到与高丹草低氰性状有关的特异性SSR 条带共26 个，其片段大小在100～750 bp（表2，图2）。从图2 还可以看出，个别条带带型较宽，例如TF3-240、TF8-100 等，这可能是相似的序列迁移造成的，需要进行琼脂糖凝胶电泳检测后进一步纯化。

图2 高丹草BSA 混池及亲本部分SSR 低氰目的片段的筛选Fig.2 Screening of low cyanide target fragments of the BSA gene pools of sorghum-sudangrass hybrid and parents

表1 9 对SSR 适宜引物的碱基序列Table 1 The nucleotide sequences of 9 pairs of SSR primers combinations

表2 高丹草SSR 低氰目的片段筛选Table 2 Screening results of low cyanide target fragments in sorghum-sudangrass hybrid

2.3 二次PCR 扩增检测与纯化

将26 个低氰SSR 目的片段切胶回收后作为模板，按原PCR 程序再次扩增，扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳 检 测 发 现 ，共 有 14 个 低 氰 DNA 片 段 目 的 片 段（TF2、TF4～TF6、TF8、TF11、TF12、TF14、TF15、TF17～TF20 和TF26）均呈现出一条清晰的DNA 条带（图3），表明这14 个片段不需要纯化；而有12 个低氰片段（TF1、TF3、TF7、TF9、TF10、TF13、TF16、TF21～TF25）出现了 2 条以上条带，说明这 12 个目的片段回收质量较差，需从SDS−PAGE 中进行纯化。

图3 26 个低氰目的片段二次扩增检测Fig.3 Secondary amplification detection of 26 low cyanide target fragments

经纯化后的12 个低氰DNA 目的片段均呈现单一清晰的条带，其分子量大小在250 bp 左右，与前面聚丙烯酰胺凝胶中的条带相吻合（150～300 bp），表明DNA 片段纯度高，纯化效果理想，符合测序要求（图4）。

图4 12 个低氰目的片段纯化检测Fig.4 Purification and detection of 12 low cyanide target fragments

2.4 目的片段测序分析

从表3、图5 和图6 可知，26 个低氰目的片段测序长度在56～672 bp 范围内，这与Marker 估计片段大小100～750 bp 有一定差异，如原片段 TF1、TF2、TF8 和 TF16 的大小分别为 300、280、100 和 550 bp，而实际测序结果分别为282、271、101 和586 bp，表明目的片段对应的Marker 迁移的位置与碱基序列的大小存在一定差异。

图6 高丹草部分低氰目的片段DNA 碱基序列Fig.6 DNA base sequence of some low cyanide target fragments in sorghum-sudangrass hybrid

表3 26 个低氰目的片段DNA 测序Table 3 DNA sequencing results of 26 low cyanide target fragments

低氰片段TF1、TF2、TF8 和TF16 的序列峰图中，用绿色、红色、黑色和蓝色4 种颜色的峰表示4 种碱基（A、T、G、C）的信号强度；图中波峰与波谷清晰，峰与峰之间的距离均匀；未出现重叠峰与碱基缺失，在底部没有杂峰干扰，表明测序结果是理想的（图5）。

2.5 同源性分析

根据DNA 测序结果，利用BLAST（http//：www.ncbi.nLm.nih.gov/BLAST/）网站序列数据库和高粱基因组数据库（http：//www.gramene.org/Sorghum_bicolor/Location）对筛选出的26 个低氰目的片段进行同源性比对发现，14 个序列具有同源性，目的片段 TF1、TF4、TF5、TF12 和 TF26 与过氧化物酶受体 XM_002758639.5、K0J259、AF310249.1、A0A2K6B7D4 和 A0A2K6RRD2 的同源性在 88.2%～100.0% 范围内；片段 TF17 与干腐菌未表征蛋白F8QJV4 的同源性为96.4%，TF18 与未培养的真菌克隆基因MT703519.1 的同源性为91.6%；片段TF21 与鼠伤寒沙门氏菌氨肽酶Q8ZQ76 的同源性为84.6%；片段TF19 和TF20 与黄孢原毛单胞菌18S RNA基因的同源性为83.2%；片段TF23 与磷脂酰丝氨酸脱羧酶原酶2 基因A0A072PQP8 的同源性为81.3%；片段TF25 与甘蓝型油菜蛋白A0A078FW90 的同源性为81.0%；而与高粱基因组序列相关的只有TF8 和TF16 2 个片段，其中TF8 与叶绿体磷酸核糖激酶XM_021458168.1 的同源性高达95.4%，片段TF16 与高粱克隆BAC 88M4 基因AY661656.1 的同源性高达到97.0%，这表明这2 个基因与高丹草的低氰性状相关，推测其是调控低氢氰酸含量性状的基因。其余的 TF2、TF3、TF6、TF7、TF9～TF11、TF13～TF15、TF22 和 TF24 这 12 个片段的碱基序列没有同源性（表4），说明前人尚未研究与这些DNA 目的片段相关的基因。

表4 高丹草低氰目的片段同源性比对Table 4 Identity of comparison of low cyanide target fragments in sorghum-sudangrass hybrid

2.6 低氰目的片段TF8 和TF16 的碱基序列比对

用DNAMAN 8.0 软件，将低氰父本红壳苏丹草及低氰F2共有目的片段TF8 和TF16 与同源性高的高粱基因AY661656.1 和XM_021458168.1 进行了序列比对和反向翻译，发现低氰父本红壳苏丹草及F2的低氰片段碱基序列完全一致，而与高粱基因的碱基比对有一定的变异。进而将低氰序列代入BLASTn，得到片段TF8 的登录号为lcl|Query_51852，片段TF16 的登录号为lcl|Query_10405。前者与高粱叶绿体磷酸核糖激酶XM_021458168.1 基因相比，发生了3 次碱基替换（C-A、A-T 和C-G）和1 个C 碱基插入，相应的丙氨酸和甘氨酸替换成半胱氨酸，苏氨酸替换成丙氨酸，而缺失了甘氨酸；后者与高粱克隆BAC 88M4 基因AY661656.1 相比，仅有一个A 碱基缺失，导致丙氨酸缺失（图7 和表5）。

表5 低氰片段TF8 和TF16 氨基酸差异Table 5 The difference amino acids of low cyanide fragments TF8 and TF16

图 5 低氰目的片段 TF1、TF2、TF8、TF16 的序列峰Fig.5 Sequence peaks of some low hydrocyanic acid target fragments TF1，TF2，TF8，TF16

图7 低氰目的片段TF8 和TF16 碱基序列特征Fig.7 Base sequence characteristics of TF8 and TF16 of low cyanide target fragments

综上，本研究首次找到了两个（XM_021458168.1 和AY661656.1）与高粱相关的低氰性状片段基因，但这两个基因的功能注释中并没有关于氢氰酸性状的描述，本试验补充了这两个基因具有调控低氰性状的作用，从而为下一步高丹草低氰性状主效QTL 精细定位、图位克隆及标记辅助等研究奠定了基础。

3 讨论

本试验将获得的26 个低氰SSR−PCR 产物片段进行回收、纯化、测序后，与BLASTn 比对发现，其在GenBank 数据库中有14 个目的片段与过氧化物酶、真菌、氨肽酶、叶绿体磷酸核糖激酶和BAC 88M4 基因的同源性在81.0%～100.0%范围内，其中叶绿体磷酸核糖激酶和BAC 88M4 分别是高粱基因XM_021458168.1 和AY661656.1 的功能注释，它们正好与低氰片段TF8 和TF16 相对应，其同源性分别高达95.4%和97.0%。进一步通过比对分析碱基序列发现，片段TF8 在XM_021458168.1 基因的218～276 bp 之间的丙氨酸和甘氨酸替换为半胱氨酸，苏氨酸替换为丙氨酸，甘氨酸缺失；片段TF16 在AY661656.1 基因的127691～127632 bp 之间仅有1个丙氨酸缺失。据此推测TF8 和TF16 这2 个低氰DNA 片段由于半胱氨酸、丙氨酸和甘氨酸发生替换和缺失，产生了调控低氢氰酸含量性状的功能。研究表明，XM_021458168.1 编码高粱叶绿体磷酸核糖激酶，而磷酸核糖激酶（phosphoribulokinase，PRK）是（calvin-benson-bassham）CBB 循环的必需酶［25−28］，表明 XM_021458168.1 可能调控氢氰酸的合成，其调控机制有待深入研究。其余12 个DNA 目的片段在现有GenBank 数据库中尚未找到同源性数据，这与刘改艳等［29］在研究乌鳢性别时发现8 个可以区分乌鳢性别的DNA 目的片段，却在GenBank 中没有找到相似的同源性数据，表明现有的GenBank 数据库还需要研究者们不断完善。

BSA 法在植物重要性状目的基因片段筛选中，已有一些成功应用的研究报道［30］。本试验采用BSA 与SSR结合的方法筛选出26 个与低氰相关的DNA 目的片段，从中首次鉴定出TF8 和TF16 这2 个DNA 目的片段基因具有调控低氢氰酸含量性状的作用，再次证明BSA 法是筛选和鉴定植物目标性状基因片段的一种有效方法，它不仅可以克服没有创建近等基因系的限制［31］，而且还具有省时和减少工作量的优点。

本试验在对高丹草低氰SSR 目的片段切胶回收过程中发现，按原引物及PCR 体系、程序进行二次PCR 扩增及产物用琼脂糖凝胶电泳检测时，出现了目的片段条带2 条以上的现象（图3），且主要出现在原目的条带相邻位置。通过与原样品聚丙烯酰胺凝胶的条带逐一对比发现，并未产生的新的SSR 条带，表明在琼脂糖凝胶电泳中出现了DNA 条带共迁移现象［32−33］。为了消除DNA 测序带来的误差，对出现共迁移现象的低氰DNA 片段条带进行了纯化，保证了DNA 片段测序的准确性（图4）。该经验可为今后类似试验研究提供借鉴。

4 结论

利用BSA−SSR 技术筛选出26 个高丹草低氰SSR 目的片段，经测序分析明确了这26 个低氰DNA 片段的碱基序列。序列比对发现，TF8 和TF16 这2 个低氰目的片段分别与高粱叶绿体磷酸核糖激酶XM_021458168.1 和高粱克隆BAC 88M4 AY661656.1 基因同源性高达95.4%和97.0%，片段大小分别为101 和586 bp。但在DNA碱基上有一定变异，TF8 片段发生了3 次碱基替换和1 次插入（C-A、A-T、C-G、C 碱基插入），导致丙氨酸和甘氨酸替换成半胱氨酸，苏氨酸替换成丙氨酸，甘氨酸缺失；TF16 片段有1 个A 碱基缺失，导致丙氨酸缺失。据此推断TF8 和TF16 低氰片段有调控低氢氰酸含量性状的功能。