郭宇航，辛 华，黄昕明，王 勇

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯市妇幼保健院，黑龙江 佳木斯154004)

近年来，肺炎克雷伯菌为临床主要检出的革兰阴性杆菌，可引起多种细菌感染。碳青霉烯类药物作为临床治疗革兰阴性致病菌感染的最后一道防线，广泛应用于临床治疗。特别是多重耐药肺炎克雷伯菌的出现，给临床治疗带来了一定的阻碍。尤其在重症监护病房的患者中检出率更高，同时由于该病房的患者年龄大、基础疾病多、机体免疫力低下等原因，使得CRKP的患者发病率和死亡率都很高。然而，越来越多的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)被检出，且呈上升趋势。本研究旨在分析CRKP耐药菌株的耐药情况和分子流行病学特点，为我院的感控工作提供一定的数据支持，同时也可以很大程度上减少耐药菌的院内传播。

1 材料与方法

1.1 菌种鉴定与药敏

对佳木斯大学附属第一医院2016～2018年非重复CRKP进行收集，通过VITEK 2 Compact进行药敏鉴定，耐药菌株K-B法复核。

1.2 仪器与试剂

药敏纸片购自英国Oxoid公司，PCR扩增仪为美国Bio-Rad公司，凝胶成像系统为上海领城生物科技公司。

1.3 表型鉴定

碳青霉烯灭活试验鉴定菌种表型。依据CLSI标准，挑取1μL满环待检菌株于肉汤，混匀加入美罗培南纸片，确认纸片完全浸没肉汤，温箱孵育4h。挑取ATCC25922单个菌落配制0.5麦氏浊度，涂布MH平板，将孵育后纸片取出贴入MH平板，过夜培养。

1.4 PCR扩增

煮沸法提取菌株DNA，PCR扩增KPC、NDM及OXA-48耐药基因，引物如下(上海生工合成)(表1)。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳及成像系统观察后测序比对(哈尔滨博仕生物公司)。

表1 引物序列

1.5 统计学方法

采用WHONET5.6软件进行统计学分析，统计学方法用χ2检验。

2 结果

2.1 鉴定及药敏

共收集31株符合条件样本，菌株对亚胺培南、美罗培南及哌拉西林/他唑巴坦耐药率较高，对左氧氟沙星耐药率较低，31株CRKP全部对阿米卡星敏感，见表2。

表2 耐药分析

2.2 表型鉴定结果

表型检测阳性结果为美罗培南抑菌圈直径6～15mm或直径16～18mm但抑菌圈内存在散在菌落。经检测，31株CRKP中有30株产碳青霉烯酶。

2.3 耐药基因检测

30株CRKP全部携带KPC-2型碳青霉烯酶基因，1株携带NDM型，未检出OXA-48型。

2.4 CRKP的标本来源

一共收集31株CRKP菌株，主要分离自痰液标本、支气管冲洗液等标本，见图1。来源中可以看出CRKP主要分布在下呼吸道标本。

图1 菌株的标本来源

2.5 实验菌株的临床科室分布

31株CRKP菌株主要分离自ICU病房，其次是神经内科，呼吸科等，见表3。

表3 CRKP的科室分布

3 讨论

CHINET中国细菌耐药监测报告显示，医院感染细菌以革兰阴性杆菌为主70.8%，以肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌以及铜绿假单胞菌为主，其中碳青霉烯耐药菌株检出率呈快速上升趋势[1]。碳青霉烯类抗生素以其有效的杀菌功效、广谱的抗菌特点作为临床治疗革兰阴性杆菌感染的重要等级药物，大量不合理的使用针对性地导致耐药菌株不断检出。革兰阴性杆菌可以“多途径—快传播”获得碳青霉烯耐药，细菌基因发生替换、插入及缺失等方式改变自身结构以适应抗菌药物并介导耐药的垂直传播[2～4]。众所周知，CRKP的主要耐药机制是产生KPC-2型碳青霉烯酶，这种类型的碳青霉烯酶在中国大陆是最常见的类型，我的研究结果也十分符合这个特点，KPC-2型碳青霉烯酶的检出率也挺高。临床治疗也随着细菌耐药机制的变化也有所不同[5]。目前为止，blaKPC已经在中国的许多地区被报道，包括北京，浙江，台湾和四川[6～9]。除此之外，金属酶，包括IMP和NDM也会导致肠杆菌科细菌的碳青霉烯抗菌药物的耐药，尤其是NDM-1，已经在全球范围内被检出，给耐药菌的治疗带来了威胁。BlaNDM-1首次被报道是来自一个瑞典患者的肺炎克雷伯菌株[10]。BlaNDM-1的快速广泛传播主要是由于质粒介导的水平传播。

本研究针对性分析了CRKP的耐药情况，结果表明，CRKP对左氧氟沙星以及阿米卡星耐药率较低，对复合抑制剂及碳青霉烯类药物耐药率较高[11]。CRKP主要的耐药机制为产碳青霉烯酶，CLSI建议采用mCIM初步鉴定是否产酶，研究结果显示31株CRKP中有30株产碳青霉烯酶，PCR扩增验证31株CRKP产KPC-2型97%及NDM型酶3%。mCIM表型检测方法条件简便、易于操作且与PCR扩增验证结果大致相符[12]。此外，mCIM结合eCIM还可以用于金属酶的检测，2018年CLSI标准建议采用eCIM筛选金属酶。KPC阳性的肺炎克雷伯菌在我国广泛流行，1996年首次分离到KPC型菌株，随后其迅速传播并在全世界相继被发现，2014年携带KPC-2型肠杆菌科细菌于土耳其一家医院发现[13]。CRKP可引起多部位、多病种细菌感染，其可用抗生素受限，通常预后不良。相关研究表明CRKP危险因素众多并且可造成较高的病死率[14,15]。对于重症监护病房的患者来说，CRKP的定植是随后发生感染的最主要的危险因素，所以对于耐药菌定植的主动筛查是非常有用的预防措施，我们通常对于住院患者采集粪便或直肠拭子，然后进行耐药菌的筛查，从而根据耐药情况采取一定的预防措施，这样可以有效地防止耐药菌的进一步播散。除此之外，经常使用抗菌药物、ICU住院时间长、血液透析等也成为了CRKP定植的危险因素。我们还需要对医护人员，特别是ICU的医护人员进行定期主动筛查，因为耐药菌可以通过医护人员进行播散，同时加强医院环境的定期消毒也十分重要，总之耐药菌的传播有许多不同的途径，我相信只要我们把每一步预防措施都尽力做好，耐药菌的传播也会得到遏制。对于CRKP分布在下呼吸道标本居多，可能和临床细菌培养标本多以留取下呼吸道标本有关。在各标本来源中所占比例还需结合更多的研究数据分析。本院CRKP主要为KPC-2型，表型鉴定结合mCIM可以有效检测碳青霉烯酶。CRKP耐药流行情况严重，临床应加强感控措施，合理使用抗菌药物。然而，我们非常需要建立一个完整的耐药细菌监测系统，可以及时地发现耐药菌并且积极地采取预防和治疗措施，这样可以很好地预防耐药细菌的播散。此外，菌株同源性及耐药传播还有待进一步研究。