黄晓燕 丘早瑜 陈丽丹 李林海

世界卫生组织(WHO)颁布的《院内感染防治实用手册》数据显示60% 的细菌感染与使用医疗器械有关［1］,包括手术器材及植入材料。银、铜具有抗菌作用早有报道,在医用耗材中加入具有强烈抗菌功能的银、铜金属纳米单质或离子均可达抗菌目的［2,3］,但其具体作用及机制尚在探索阶段,无统一标准。本实验通过研究Ag+、Cu2+对临床常见致病细菌［大肠埃希菌(escherichia coli,CRE)、肺炎克雷伯菌(carbapenemresistant klebsiella pneumoniae,CRKP)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,PAE)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,MASA)及粪肠球菌(enterococcus faecails,EFA)］的抗菌性能,为临床使用和研发新型抗菌材料提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1Ag+、Cu2+溶液的配制 利用灭菌去离子水配制浓度均为 0.1 M 的硝酸银(AgNO3)和氯化铜(CuCl2·2H2O)水溶液,用0.22 m 的滤菌器过滤后装在无菌容器备用,其中硝酸银的配制及保存需要避光操作。

1.1.2菌株

1.1.2.1临床菌株 随机选取本院检验科微生物室分离的来源于伤口分泌物及组织的多重耐药菌株饰物CRE、CRKP、PAE、MARA、EFA,所有菌株均采用法国梅里埃VITEK MS 全自动快速微生物质谱检测仪进行鉴定,菌株保存于-80℃冰箱。

1.1.2.2标准 菌株 CRE(ATCC25922)、CRKP(ATCC700603)、PAE(ATCC27853)、MARA(ATCC25923)、EFA(ATCC29212)干粉均购自广东临床检验中心,溶解后转种血平板备用。

1.1.2.3菌株贮存 将上述临床菌株及标准菌株接种至血平板,35℃ CO2温箱培养24 h 备用。

1.1.3阳离子调节肉汤(CAMHB) 的配制 称取CAMHB 肉汤干粉22.0 g,加热溶解于1000 ml 去离子水中,121℃高压灭菌20 min 备用。

1.1.4无菌去离子水 取去离子水121℃高压灭菌20 min 后备用。

1.2方法

1.2.1菌悬液的制备［4］取上述所有菌株的24 h 新鲜培养物接种至CAMHB 肉汤,35℃ CO2温箱恒温增菌6 h 后,用比浊仪配制成0.5 麦氏单位的菌悬液(相当于108cfu/ml),再用无菌去离子水梯度稀释为100 倍,使之成为106cfu/ml 的菌悬液,备用。

1.2.2梯度浓度Ag+、Cu2+溶液的配制 将0.1 M 的Ag+、Cu2+离子溶液梯度稀释为10-2～10-8M 的溶液,备用。

1.2.3Ag+、Cu2+离子抑菌实验 实验孔：分别取100 μl 配制好的10-2～10-8M 浓度Ag+、Cu2+离子溶液置于96 孔板中,加入106cfu/ml 细菌悬液100 μl,振荡混匀。以上步骤重复3 次作平行试验,盖好盖板,置35℃CO2温箱共同培养 6 h。对照孔：取100 μl 灭菌去离子水置于96 孔板中,加入106cfu/ml 细菌悬液100 μl,振荡混匀。以上步骤重复3 次作平行试验,盖好盖板,置35℃ CO2温箱共同培养6 h。取出培养液,吹打混匀,每孔用无菌去离子水稀释100 倍,各取100 μl 接种至血平板,置35℃ CO2温箱培养24 h,记录平板菌落数取平均值,计算杀菌率。杀菌率(%)=(Ncontrol-Nsample)/Ncontrol×100%。Ncontrol 为空白组菌落数,Nsample为实验组菌落数。

1.3观察指标及判定标准 比较两种离子对CRE、CRKP、PAE、MARA、EFA 及ATCC25922、ATCC700603、ATCC27853、ATCC25923、EFAATCC29212 的MBC。参照GB/T 2591 标准,杀菌率≥99%可以报告有强抗菌作用；杀菌率≥90%可以报告有抗菌作用。

1.4统计学方法 应用软件GraphPad Prism 7.04 对数据进行处理和运算。

2 结果

①当Ag+浓度≥10-7M、Cu2+浓度≥10-5M 时,对CRE 有杀菌作用；当Ag+浓度≥10-6M、Cu2+浓度≥10-4M 时,对ATCC25922 有杀菌作用。两种离子对CRE 的MBC 均较ATCC25922 小。见图A1,图B1。

A1 Ag+ concentration

B1 Cu2+ concentration

②当Ag+浓度≥10-7M、Cu2+浓度≥10-6M 时,对CRKP 有杀菌作用；当Ag+浓度≥10-7M、Cu2+浓度≥10-6M 时,对ATCC700603 有杀菌作用。两种离子对CRKP 的MBC 与ATCC700603 一致。见图A2,图B2。

A2 Ag+ concentration

B2 Cu2+ concentration

③当Ag+浓 度≥10-6M、Cu2+浓 度≥10-5M 时,对PAE 有杀菌作用；当Ag+浓度≥10-7M、Cu2+浓度≥10-6M 时,对ATCC27853 有杀菌作用。两种离子对PAE 的MBC 均比ATCC27853 高。见图A3,图B3。

A3 Ag+ concentration

B3 Cu2+ concentration

④当Ag+浓度≥10-7M、Cu2+浓度≥10-6M 时,对有MASA 杀菌作用；当Ag+浓度≥10-7M、Cu2+浓度≥10-6M 时,对ATCC25923 有杀菌作用。两种离子对MASA 的MBC 与ATCC25923 一致。见图A4,图B4。

A4 Ag+ concentration

B4 Cu2+ concentration

⑤当Ag+浓 度≥10-5M、Cu2+浓 度≥10-5M 时,对EFA 有杀菌作用；当Ag+浓度≥10-6M、Cu2+浓度≥10-5M 时,对ATCC29212 有杀菌作用。对于Ag+,EFA 的MBC 比ATCC25923 高,但对于Cu2+,两种细菌的MBC 一致。见图A5,图B5。

A5 Agg++ concentration

B5 Cu2+ concentration

3 讨论

通过实验,可以观察到临床菌株与标准菌株的MBC 相同或者变化不大,均只需要较低的Ag+、Cu2+浓度,就可以达到卓越的抑菌效果,推测其杀菌能力与细菌的耐药性相关性不大。在细菌感染耐药率高居不下的现状下,Ag+、Cu2+的研究前景是可观的,有望为临床新材料的开发带来新的飞跃。同时,Ag+、Cu2+对革兰阴性杆菌的抑菌作用比革兰阳性球菌强,对PAE及EFA 的杀菌性能较差,分析可能与细菌的结构及耐药机制有关。在结构上,由于革兰阳性球菌的细胞壁比阴性杆菌厚,金属离子不能轻易渗透到细胞内,故MBC 相对较大；其次,PAE 的耐药机制中的细胞膜通透性改变(如孔蛋白减少、生物被膜的形成),可能减少离子的摄取和吸收,且具有主动外排系统能把Ag+、Cu2+泵出菌体外而导致MBC 变大；而EFA 的MBC 增大原因主要为细胞壁渗透障碍导致Ag+、Cu2+难以进入菌体,及质粒介导的钝化酶的产生有对Ag+、Cu2+的破坏和灭活的作用等,故抑菌效果相对弱。尽管如此,Ag+、Cu2+仍然对所有实验菌株具有高度敏感性。目前关于金属离子的应用大多是伤口外用敷料及皮肤表面的涂抹、喷洒消毒［5-7］,且其抑菌作用的研究大多数采用标准菌株,很少用临床菌株,本文选用来源于伤口分泌物及组织的临床菌株与标准菌株对比来研究Ag+、Cu2+的抑菌性能,更贴近临床实际。

综上所述,Ag+、Cu2+对临床五种常见致病菌及标准菌株均有明显抑菌作用,可作为除抗生素外的新型有效抗菌材料广泛应用于临床。