吴洁莹，吴韶清，陈劲松，陆 琰，汤雪薇，李 焱

（广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心<广州脐血库> 广东 广州 510623）

与骨髓和外周血干细胞的供者资料库不同，脐血库是将脐带血以实物形式置于液氮中长期冻存，一旦与受者匹配，可在短时间内快速解冻并回输。虽然极大提高了治疗的可及性，但是，长期冻存和复苏都会不可避免地影响脐带血的造血功能[1-3]。由于脐带血只能采集一次，数量有限，可供检测的样本更少。如何快速、准确地评价复苏后脐带血的造血功能，是脐血库质量控制、产品放行，及移植中心供体选择、风险评估等过程中都必须关注的重点[4-5]。本文探讨非离心的免疫磁珠法在检测冷冻复苏后脐带血造血功能中的应用。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选择广州脐血库2014 年11 月—2018 年1 月的76份样本（常规法组）和2018 年2 月—2020 年12 月的73份样本（新方法组）。冷冻前从脐血采集袋取样，复苏后从附属血辫取样。此阶段实验室的操作环境和仪器设备运行稳定，技术人员相对固定，数据具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器IMDM 培养基购自美国Gibco 公 司， 批 号：1843036/2150863； 胎 牛 血清 购 自 美 国Gibco 公 司，批 号：1908360C；DNA 酶（RNase-Free DNase）购自美国Promega 公司，批号：0000231528/0000335463；ErythroClearTMRed Blood Cell Depletion 试剂盒购自加拿大Stemcell 公司，批号：19C101192/1000012783；台盼蓝染液购自Sigma 公司，批号：TRB0850；甲基纤维素半固体培养基购自加拿大Stemcell 公司，批号：18M98047/1000019901；流式抗体：CD45-异硫氰酸荧光素（FITC）、CD34-藻红蛋白（PE）、免疫球蛋白（IgG）-PE、7-氨基放线菌素（AAD）及溶血素购自美国BD 公司，批号：8311690/8341967/9015 728/9134970/9029989；生物洁净工作台购自苏州苏静安泰空气技术有限公司，型号：BCM-1600A；低温高速离心机购自美国IEC 公司，型号：GP8 R；流式细胞仪购自美国BD 公司，型号：BD FACS Canto Ⅱ；血细胞分析仪购自美国贝克曼库尔特公司，型号：Ac.T diff2，恒温水浴箱购自美国Coring 公司，型号LSE waterbath 6 L；旋涡震荡仪购自美国IKA 公司，型号：LAB Dancer S25；医用冷藏箱购自海信（北京）电器有限公司，型号：BCD-196TA；CO2培养箱购自德国Labotect 公司，型号：C200；倒置显微镜购自日本Olympus 及Nikon 公司，型号：CHK 及TE300。

1.2.2 常规法（洗涤离心）将脐血从液氮中移至气相，放置5 min。打开铝夹，取出附属血辫，浸入37℃恒温水浴箱，快速完成复温。取100 uL样本用于有核细胞计数、活率检测，其余约400 ～500 uL 转移至15 mL 无菌离心管，缓慢加入预冷的含2%胎牛血清（FBS）和10 U/mL DNase 的IMDM 培养基，轻轻摇动离心管。置10℃条件下，1 500 rpm、离心10 min。小心取出上清液，重悬细胞沉淀。重复洗涤离心一次。弃去上清，加入IMDM 培养基重悬细胞，用于CD34 阳性细胞检测和干/祖细胞集落培养。

1.2.3 新方法（磁珠法）同前复温后，取50 uL 样本用于有核细胞计数。另取50 ～100 uL 样本置于2 mL无菌离心管，加入280 uL 含2%FBS 的磷酸盐缓冲液（DPBS）及170 uL ErythroClearTM试剂，用吸头彻底混匀，室温（15 ～25℃）孵育1 min 后，开盖置于磁极中，静置1 min。期间观察是否出现细胞分层现象（即上层为透明清亮液体，底部为斜面状红细胞沉淀）。待分层稳定后，用1 000 uL 吸头沿离心管壁，小心吸取上清液，转移至另一新无菌离心管（切勿触碰底层红细胞沉淀），用于活率、CD34 阳性细胞检测和干/祖细胞集落培养。详见ErythroClearTMRed Blood Cell Depletion 试剂盒操作说明。

1.2.4 样本检测 有核细胞计数：采用全自动血细胞分析仪进行检测。读取屏幕上显示的白细胞（WBC）数值，细胞总数=WBC×脐血体积。

细胞活率检测：采用0.4%台盼蓝染色检测活细胞数量，计数100 个有核细胞，被染色的为死细胞，未染色的为活细胞，计算活细胞比例。

CD34 阳性细胞计数：标记流式管，设同型对照，将制备好的细胞悬液各50 uL 分别加入对照管及实验管，对照管加入10 uL CD45-FITC 及10 uL IgG-PE 荧光抗体，实验管加入10 uL CD45-FITC 及10 uL CD34-PE 荧光抗体，避光孵育20 min。各管分别加入5 uL 7-AAD，继续孵育5 min。加入2 mL PBS，于1 500 rpm 离心5 min，弃上清，再以300 uL PBS 重悬细胞沉淀，上机检测。采用洗涤离心制备的细胞悬液，标记后还要溶血。分析结果得到CD34 阳性细胞占CD45 阳性有核细胞的百分比，再根据复温后脐血的细胞总数，计算出每份脐血中的CD34 阳性细胞的数量。

造血祖细胞集落分析：采用MethodCult（GF H4434半固体甲基纤维素培养基，以105细胞/mL 的密度接种于12 孔板中，每孔终体积1 mL，每样本设双复孔。置37℃、5% CO2饱和湿度下培养14 ～16 d。倒置显微镜下观察粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GMs）、爆式红细胞集落形成单位（BFU-E）和粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位（CFU-GEMM），求和得到祖细胞集落形成单位总数（CFUs），再根据复苏脐血的细胞总数，计算出每份脐血中的集落数量。

1.3 观察指标

选择两组样本冷冻前后的总有核细胞数、细胞活率、CD34 阳性细胞数、CFU-GMs 及CFUs 和上述各项参数的变化（回收率）为观察指标，计算公式如下。

总有核细胞回收率（%）=（复苏后细胞数/冷冻前细胞数）×100%。

细胞活率（%）=[活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）]×100%。

细胞活率回收率（%）=（复苏后细胞活率/冷冻前细胞活率）×100%。

CD34 阳性细胞回收率（%）=（复苏后CD34 阳性细胞数/冷冻前CD34 阳性细胞数）×100%。

CFU-GMs 回收率（%）=（复苏后CFU-GMs 数量/冷冻前CFU-GMs 数量）×100%。

CFUs 回收率（%）=（复苏后CFUs 数量/冷冻前CFUs 数量）×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差（± s）表示，组间比较采用t检验和Wilcoxon 秩和检验；连续变量之间的相关性采用Spearman 相关性分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 两组脐血的冷冻前和复苏后的各项参数及回收率比较

两组样本复苏后的总有核细胞数、细胞活率、CD34阳性细胞数、CFU-GMs 及CFUs 数量较冷冻前均有所降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。新方法组的细胞活率的回收率低于常规法组，差异有统计学意义（P＜0.001），而两组的有核细胞回收率、CD34 阳性细胞回收率、CFUGMs 回收率和CFUs 回收率等的差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组脐血的冷冻前和复苏后的各项参数及回收率比较

2.2 两组脐血的复苏后CD34 阳性细胞数和CFUs 的相关性分析

两组样本的CD34 阳性细胞数和CFUs 数量均有相关性（新方法组：r=0.744，P＜0.001；常规法组：r=0.631，P＜0.001），见图1。

图1 两组脐血的复苏后CD34 阳性细胞数和CFUs 的相关性曲线

3.讨论

脐带血的制备是采用仪器或手工分离法，去除大部分的血浆和红细胞，收集富含造血干细胞等多种干细胞及免疫细胞的白膜层，保存于液氮中的完整过程。为保证回收率，终产品可能含有一定比例的红细胞，而这些红细胞会影响造血干/祖细胞（HSPCs）的造血功能评价，如：CD34 阳性细胞流式检测、集落形成单位数量分析，乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测等的准确性[6-7]。常规去除红细胞的方法包括洗涤沉降法或氯化铵裂解法，均需要较长作用时间或离心，对冷冻复苏后样本，易造成细胞损伤、凝块，导致细胞丢失。与冷冻袋相比，附属血辫中的微量样本在降温程序中处于更低的温度，对冰晶损伤可能更敏感，因此常规方法尤其不适于冷冻袋的附属血辫中微量样本的检测[8-10]。本库自2018 年2 月起，采用加拿大Stemcell 公司的ErythroClearTM试剂盒，取代洗涤离心溶血的常规方法，对脐带血附属血辫中的微量样本进行检测。虽然两种方法制备的脐血样本的总有核细胞数、细胞活率、CD34 阳性细胞数、CFU-GMs 及CFUs较冷冻前均有所降低（P＜0.05），但是，两组样本的冷冻前后CD34 阳性细胞回收率，粒-巨噬细胞集落回收率、祖细胞集落回收率均无显著差异（P＞0.05）；同时，两组样本复苏后的CD34 阳性细胞数和CFUs 均存在高度相关性，表明CD34 阳性细胞数的测定结果均能准确反映出具有该标记的造血干/祖细胞的生物学特性，新方法不会改变样本的造血干/祖细胞分布频率和增殖能力。但本研究的数据也显示，新方法组的细胞活率的回收率低于常规法组，表明新方法对细胞活率的检测有一定影响。

新方法的优势主要有两个方面：首先是减少操作时间，提高制备效率：常规法将复苏后的脐带血加入预冷的培养基稀释后，小心混匀离心洗涤两次，弃去上清，加入缓冲液，反复轻柔吹打调整至适宜浓度的细胞悬液，操作时间大于20 min；而磁珠法将样本加入缓冲液和磁珠分离试剂，混匀后静置1 min，再放入磁极作用约1 min 或至细胞悬液清晰，即可吸出上清液。由于磁极有16 个样本位，可在约2 min 内同时完成16 个待检样本的红细胞分离，极大地提高了制备效率。其次是节约样本量，改善制备质量：磁珠法仅需要约50 ～100 uL 的血样制备细胞悬液，并可立即用于流式分析和干/祖集落培养，若置于4℃静置存放，也很少出现细胞凝集成团的现象；而常规法需要400 ～500 uL 血样，经过反复离心、洗涤、吹打，即使在体系中加入DNase，也容易产生肉眼可见的细胞凝块。为保证流式检测中管路通畅，顺利收集到细胞信号，通常需要用400 目滤膜去除凝块。同时，由于损失了相当数量的细胞，给流式结果的分析造成一定困难。

当然，新方法也存在局限性。首先，磁珠吸附后获得的细胞悬液终体积约500 uL（上样体积为550 uL，扣除吸附在磁极中的红细胞及磁珠沉淀），有时会导致细胞终浓度偏低；若减少上样体积，又会影响分离体系和磁极作用面积，降低分离效率。如果后续实验对样本浓度和样本体积有要求（如细胞分选），则须增加离心浓缩步骤。另外，磁极作用后的细胞活率会降低，但在处理新鲜血液样本时，此现象并不明显（数据未显示），推测可能原因有：（1）与磁场有关，冷冻复苏后的细胞对磁场作用更敏感；（2）与试剂有关，磁珠或缓冲液可能与检测细胞活率的试剂发生干扰，造成假阳性，值得进一步研究。

综上所述，免疫磁珠法可用于快速检测冷冻复苏后的脐带血造血功能，特别适用于冷冻袋附属血辫的微量样本。以本库采用的50 mL CryoMACS®冷冻袋为例，含有脐带血终产品的冷冻袋在密封前应保留的一段附属连接管（血辫），其容量约为600 uL。每次需100 uL 血量，使总量约600 uL 的附属血辫可分为数小段，进行多项目多次检测，可以满足现行的全球先进输血和细胞治疗联盟（AABB）《细胞治疗服务标准（第9 版）》（9th edition）中“脐血产品至少需要两个完整的附属血辫与产品一起冷冻保存”及“用于造血重建的产品在附属连接段取样检测集落形成单位和（或）CD34 阳性细胞（直接测量）”的规定[11]。