卢香凝, 郑 行, 路延笃

(1.福清市新大泽螺旋藻有限公司,福建 福州 350300；2.海南大学海洋学院,海南 海口 570228)

小球藻是绿藻门Chlorophyta、小球藻属Chlorella中的一种单细胞藻类,细胞直径约3～8 μm,需要在显微镜下才能分辨[1].它的光合效率高、固定碳氮能力强、代谢途径丰富,富含蛋白质、脂肪、多糖、维生素、色素等多种生物活性物质,在食品、医药、环保、基因工程、液体燃料等领域具有很高的应用价值[2-5].目前,微藻的生物质可以达到10万 t干重的年产量和超过30亿美元的年产值,其中小球藻约占30%的份额,且呈逐年上涨的趋势[6].由此可见,小球藻的规模生产和产业开发具有十分广阔的前景和市场.然而在当前的微藻规模化养殖过程中存在着一些亟待解决的问题,比如藻种耐受能力差、易产生杂藻污染、细胞浓度低、产量不稳定等[7-10].

微藻的规模化养殖主要受生产地的环境条件影响,影响因子主要包括(1)温度：大多数微藻的最佳生长条件是20～25 ℃,然而不同地域之间具有较大的温差.相较于我国北方地区而言,在我国南方地区,如海南岛的年均气温在22～27 ℃,夏季最高温时可达40 ℃,过高的温度会使微藻减产,严重时会导致绝收[11].(2)光照：光强是制约光合作用效率最关键的环境因子.在当前常见的规模养殖微藻种类中,如微拟球藻的最适光照强度为50～100 μmol·m-2·s-1,但是我国南方地区的太阳高度角较大,获得的太阳辐射较高,夏季的平均光照强度达500 μmol·m-2·s-1,远远超过了光合作用可利用的水平,过量的光照会对微藻的光系统造成伤害,抑制光合作用,降低光合效率[12].(3)污染：微藻在培养过程中出现微生物污染是当前急需解决的重要问题之一,比如在试验室条件下出现细菌或真菌污染会危及藻种的保藏,特别是稀有物种和重要的突变体；在规模养殖过程中出现细菌和真菌感染,会由于菌落数过高而大大降低产品质量,甚至使产品不达标[13].研究表明[14]，通过提高培养基盐度可以在一定程度上减少污染,然而对于相当一部分微藻而言,盐度的提高往往导致生长速率的下降.因此筛选并鉴定出对温度、光照和盐度具有宽幅适应范围且适应于生产应用的微藻种质资源,是实现微藻产业化过程中最基础也是最重要的一个环节,对于推动微藻生物技术的理论研究和现实应用具备重要的意义.

1 材料与方法

1.1 试验材料

小球藻Chlorellasp. MEM25从海南盐碱地区采集的盐卤水样品中分离获得；试验中对照组的微拟球藻NannochloropsisoceanicaIMET1取自于本实验室藻种库.

1.2 藻种的分离纯化与形态学观察

采用梯度稀释法对藻种进行分离,将采集的盐卤水样品取15 mL进行离心收集,去掉上清液,取底层50 μL样品涂布于固体F2培养基,在25 ℃条件下培养2周后挑取绿色克隆,将其划线接种于F2平板倒置培养3周,重复3次获得纯化后的MEM25.在F2固体培养基上纯化获得MEM25后,直接观察该藻的群落特征；挑取纯化后的藻种群落,置于F2液体培养基中培养2周,取藻液观察形态学特征.

1.3 藻种的同源性分析

参照Gan et al[15]方法提取MEM25的基因组DNA并进行18S rRNA的PCR扩增,取2 μL PCR产物经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测,余液置于4 ℃保存,之后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序,将测序后获得的18S rRNA基因序列提交GenBank数据库进行多重序列比对,与NCBI上已有的序列进行相似性比较分析,从而确定该藻株的种属.

1.4 藻种的耐受性试验

1.4.1 盐度对藻种生长的影响 将培养一段时间后的MEM25和IMET1离心收集,取藻泥分别接种于盐度为1.8 %、3.5 %、7.0 %、10.5 %的无菌F2液体培养基,置于温度25 ℃、光强50 μmol·m-2·s-1、在光照时间24 h的培养箱中培养,于2、4、6、8 d测定各试验组的D750 nm；于0、1、3、6、12、24、48、96 h测定1.8 %、7.0 %组的Fv/Fm.

1.4.2 光照对藻种生长的影响 将培养一段时间后的MEM25和IMET1离心收集,取藻泥接种于无菌F2液体培养基,置于温度25 ℃、每天光照时间为24 h、光强分别为50和200 μmol·m-2·s-1的培养箱中培养,于2、4、6、8 d测定各试验组的D750 nm；于0、1、3、6、12、24、48、96 h测定200 μmol·m-2·s-1组的Fv/Fm.

1.4.3 温度对藻种生长的影响 将培养一段时间后的MEM25和IMET1离心收集,取藻泥接种于无菌F2液体培养基,置于光强50 μmol·m-2·s-1,光照时间为24 h、温度分别为15、25、28、35 ℃的光照培养箱培养,于 2、4、6、8 d测定各试验组的D750 nm；于0、1、3、6、12、24、48、96 h测定15、35 ℃组的Fv/Fm.

1.5 藻种的模拟户外培养

在室内模拟海南的户外环境,采用容积为100 mL的立柱式光生物反应器培养MEM25和IMET1,培养过程中全程给予盐度为7.0 %、温度为30～34 ℃、光照为250～350 μmol·m-2·s-1的条件.10 d后收集藻样本,参照Wu et al[16]的方法测定细胞干重和蛋白质含量,按照Xin et al[17]方法测定脂肪酸.

1.6 藻种的户外养殖

将小球藻MEM25接种于体积为500 L的管道式户外光生物反应器,初始接种密度为0.5×107个·mL-1,共培养7 d,期间每天进行显微镜观察并做细胞计数.细胞计数方法为：藻细胞密度(个·mL-1)=N/5×25×104×稀释倍数.其中：N代表5个中方格的细胞总数；N/5是计算每个中方格的平均细胞数量；N/5×25是计算中央大方格细胞总数；N/5×25×104是1 mL体积中的细胞个数.细胞的日增长量用μ=Ny-Nx/ty-tx来计算,其中Nx和Ny分别是细胞在tx和ty时的细胞数.

1.7 数据统计与分析

采用Excel 2013版本进行数据处理，采用SPSS 18.0进行统计学分析.

2 结果与分析

2.1 形态学观察

通过平板划线培养后(图1)，MEM25呈现绿色、半湿润、凸起状藻落,挑取该藻株接种于液体F2培养基,培养2周后形成绿色藻液,显微观察结果显示该藻株的细胞呈球形,直径约为2～8 μm,无鞭毛.

a.MEM25的菌落形态;b.MEM25的显微特征.图1 MEM25的菌落形态和显微特征Fig.1 Morphological characteristics of MEM25

2.2 同源性分析

将MEM25的18S rRNA基因序列提交至GenBank数据库(MF737085)进行多重序列比对,与已有效发表的藻株进行序列相似性分析,发现其与小球藻属模式藻株Chlorellavulgaris的序列相似性最高(98.0%).

2.3 耐受性试验

2.3.1 MEM25对高盐的耐受性 如图2所示，MEM25在4种盐浓度条件下的生长状态都呈上升趋势,且在7.0 %盐度条件下的生物量最高,第8天时D750 nm为3.66,与初始相比增长12.2倍；在105‰盐度条件下的生物量最小,第8天时D750 nm为2.095,与初始相比仍增长了6.93倍.IMET1在1.8 %、3.5 %、7.0 %下均呈上升趋势,且在3.5 %盐度条件下的生物量最大,第8天时的D750 nm为2.02,较初始值增长了6.73倍；但是IMET1在10.5 %盐浓度条件下的生长明显受到过高盐度的抑制,第8天的D750 nm为0.45,生物量仅增长1.3倍.在1.8 %、3.5 %、7.0 %条件下,MEM25的生物量比IMET1均高出约2倍；在10.5 %盐浓度条件,MEM25的生物量是IMET1的4.65倍,且MEM25的Fv/Fm始终比IMET1高.因此较IMET1而言,MEM25对于盐度的耐受范围更宽、耐受能力更强.

2.3.2 MEM25对高光的耐受性 如图3所示,随着培养时间的增加,MEM25在两种条件下的生长速率均表现出上升趋势,在高光照250 μmol·m-2·s-1条件下的D750 nm达到最大,较初始相比增长了5.26倍；而IMET1的生长趋势在两种条件下均表现出先上升后下降的趋势,仅在低光照50 μmol·m-2·s-1条件下达到最大D750 nm.无论是50 μmol·m-2·s-1还是250 μmol·m-2·s-1条件下,MEM25的D750 nm均显著高于IMET1.在250 μmol·m-2·s-1条件下,MEM25的Fv/Fm始终比IMET1高,说明MEM25对高光具有更强的耐受能力.值得注意的是,试验中二者的Fv/Fm都表现为先降后升、之后再下降的趋势,这说明在高光条件下二者都受到胁迫,但藻株自身对于胁迫条件会逐步进行自我调整,且MEM25的自适应能力更强.

图2 不同盐度下MEM25与IMET1的D750 nm和Fv/FmFig.2 D750 nm and Fv/Fm values of strains MEM25 and IMET1 under different saline conditions

图3 不同光强下MEM25与IMET1的D750 nm和Fv/FmFig.3 D750 nm and Fv/Fm of MEM25 and IMET1 in different illumination

2.3.3 MEM25对高温的耐受性 如图4所示,在4种温度条件下,MEM25的D750 nm均随着时间的增加而逐步增加,在35 ℃条件下达到最大值,与初始浓度相比增长了10.6倍.IMET1的生长趋势则与MEM25相反,在15 ℃条件下IMET1拥有最大D750 nm,与初始时相比增长了8.9倍,但随温度升高,IMET1的生长开始呈现下降趋势.在35 ℃条件下MEM25的D750 nm达到最大,而此时的IMET1因受到高温胁迫导致死亡.随着时间推移,二者的Fv/Fm都呈逐步下降趋势,但IMET1比MEM25的Fv/Fm更低,特别是从第48 h开始IMET1的Fv/Fm已降到0,说明藻株已经死亡.因此较IMET1而言,MEM25对于高温的耐受能力更强.

图4 不同温度下MEM25与IMET1的D750 nm和Fv/FmFig.4 D750 nm and Fv/Fm of MEM25 and IMET1 in different illumination

2.4 模拟户外条件培养MEM25

在室内模拟海南的户外环境条件培养MEM25和IMET1,藻液随着培养时间的增加而颜色逐渐变深,且MEM25的颜色比IMET1的颜色更深.在第10天收集样本测定二者的干重和蛋白质,结果如图5所示,MEM25和IMET1的干重分别为1.88和0.73 g·L-1,MEM25的干重是IMET1的2.58倍；MEM25和IMET1的蛋白质含量分别为53%和32%,MEM25的蛋白质含量是IMET1的1.66倍.与IMET1相比,MEM25在模拟户外培养条件下不仅能保持良好的生长趋势,还能大量积累干物质和蛋白质,具有较高营养价值.

图5 MEM25与IMET1的干重和蛋白质含量Fig.5 Dry weight and protein of MEM25 and IMET1

图6 MEM25的户外生长情况Fig.6 Growth of MEM25 outdoor

2.5 户外培养MEM25

将小球藻MEM25采用户外光生物反应器共培养7 d,结果如图6所示,小球藻MEM25的细胞浓度随着培养时间的增加而增长,在第8天采收时的细胞浓度达到最高值12.65×107个·mL-1,是初始接种浓度的25倍.从细胞的日增长量上看,其规律呈现先增加后降低的趋势,其中最大日增长量为3.31×107个·mL-1.收集第8天的小球藻MEM25样本用于测定氨基酸和脂肪酸的含量(图7),可以看到小球藻MEM25的氨基酸种类齐全且必需氨基酸含量丰富,其中必需氨基酸含量占总氨基酸含量的49.5%；此外小球藻MEM25的不饱和脂肪酸占比大,特别是必需脂肪酸C18∶2和C18∶3的含量分别为30.9%和34.7%.综合以上来看,利用户外的光生物反应器培养的小球藻MEM25不仅生长迅速而且具有较高的营养价值.

图7 MEM25的氨基酸和脂肪酸含量Fig.7 Amino acid and fat acid of MEM25

3 讨论

目前用于规模生产的微藻种类主要包括螺旋藻、小球藻、雨生红球藻、杜氏盐藻、三角褐脂藻等[18-21].通常在试验室条件下,各种微藻的生长速率和生物量都能够达到最佳状态[22]；然而在规模化培养过程中,由于环境条件的改变导致藻种的生长速率降低、抗逆性下降,最终导致减产[23],因此如何提高微藻的规模化养殖效率是当前微藻产业中的重要议题.影响微藻规模化养殖的因素主要有藻种、培养条件和光生物反应器等方面[24],其中藻种的繁殖能力、抗逆性和营养多样性对规模养殖效率有着直接的影响[25],比如有学者从沼液中筛选到一株耐污性较强的小球藻,将其实现规模化养殖后并采收,检测其蛋白质含量达62.56%,表明该藻株具有作为优质蛋白饲料的潜力[26]；Andreas筛选出嗜盐性扁藻TetraselmisMUR-167并实现规模化养殖,该藻株在养殖过程中不仅能产生较高的油脂量,还具有突出的耐污染特性[27].然而并不是所有的藻种都适合规模化的人工培养,在实践中有学者发现很多藻种在规模化培养中会出现各种问题,比如Sing在户外规模培养硅藻Amphorasp.过程中由于扁藻Tetraselmissp.污染了培养体系而导致试验失败[28]；Moheimani在培养颗石藻Pleurochrysiscarterae时遇到暴雨天气,致使培养液盐度骤降,从而导致试验失败[29].由此可以看出微藻种质资源对于微藻生物技术的发展来讲十分重要,藻种性状是否优良会对规模化养殖效率和产品品质产生直接影响,只有具备宽泛的环境适应性和耐受性的藻种才更适用于规模养殖.因此,不断地筛选、更新藻种是推动微藻产业发展的重要工作之一,本试验中所筛选到的小球藻MEM25与IMET1相比拥有高效的生长速率和卓越的环境耐受性并在户外能够实现高效率养殖.基于本试验结果,未来将针对MEM25开展进一步的户外规模化养殖和应用试验.